专利名称：用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法
技术领域：
本发明公开了一种利用转基因动物生产药用蛋白的方法，特别公开了一种利用核移植制备在奶中生产人组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因奶山羊的方法。
背景技术：
人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-plasminogen activator，t-PA)突变体(t-PAm)是本申请单位已获得专利的新型蛋白(军事医学科学院生物工程研究所中国专利号ZL93109234.5)。它对血栓中存在的纤维蛋白—纤溶酶原复合物有高度亲和力，能迅速形成纤维蛋白-t-PAm-纤溶酶原复合物，激活纤溶酶原形成纤溶酶，水解血栓中的纤维蛋白(刘士辉、黄培 堂等，组织型纤溶酶原激活剂突变体的构建、表达及特性分析。中国科学(B)，1995，4399)。然而由于t-PAm本身结构的复杂，有较多的二巯键和糖基化位点，原核表达系统不易获得有活性的t-PAm，哺乳动物细胞表达系统虽能合成有活性的重组t-PAm，但表达效率较低，生产工艺繁琐，周期长成本高。通过建立转基因动物乳腺生物反应器来生产t-PAm可有效解决这些问题。将t-PAm基因定位整合到哺乳动物基因组中，在乳腺特异性表达启动子的调控下可使t-PAm基因在乳腺组织中表达，不会在体内造成蓄积而产生危害，并且t-PAm基因的表达产物在翻译后可被修饰而具有原有的生物活性。另外，从乳汁中提取外源蛋白相对简单，加之转基因动物的表达特性能较稳定地遗传给后代。这样无论是系统的建立，还是系统的维持和扩大，在成本上与原核系统或组织培养系统相比，乳腺个体表达系统都具有较多优点(Hennighausen L.The prospectsfor domesticating milk protein genes.J Cellular Biochem.1992，49325～332.)。
随机整合载体构建相对容易，转基因制备选择的方法较多，但在转基因动物建立的过程中，由于基因表达调控本身的复杂性以及外源基因在动物基因组中整合的随机性，使得外源基因在宿主动物体内的表达水平大多停留在一个较低水平，并且个体间表达水平差异很大。为此，国内外学者对影响外源基因在体内表达的各种调控成分进行了大量的研究。虽然，大多研究表明这些人工拼接的调控成分能对外源基因的表达效率有一定的正效应影响，但无法得到生物自身内源性调控元件原有功能的正常体现。另外，转基因动物个体间所存在的表达水平的较大差异，主要归因于外源基因在基因组中随机整合而带来的“位置效应”。多数学者认为，即使使用现今所有的已知功能的生物学元件来构建乳腺组织特异性表达载体或选用现今所有的基因导入技术都无法克服转基因表达的“位置效应”。而外源基因在基因组中定位整合却能全面解决并克服这一难题。将外源基因定位整合到家畜体细胞的乳蛋白基因座，由转基因体细胞通过核移植技术生产乳腺生物反应器动物，能够充分利用内源乳蛋白基因固有的高效表达调控机制。这是当今转基因乳腺生物反应器动物生产的最理想模式，它在一定程度上避开了乳用家畜胚胎干细胞建系这一难题(Piedrahita JA.Targeted modification of the domestic animal genome.Theriogenology，2000，53105～116.McCreath KJ，Howcroft J，Campbell KHS，et al.Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from culturedsomatic cells.Nature，2000，4051066～1069.)。
发明内容
本发明就是以t-PAm基因为目的基因，分别构建了随机整合和基因打靶载体，利用随机整合和基因打靶技术把t-PAm整合到山羊胎儿成纤维细胞DNA上或定位敲入到山羊胎儿成纤维细胞的β-酪蛋白基因座中，并通过体细胞核移植来生产转基因动物，从而达到乳腺生产t-PAm的目的。开发具有高特异性与亲和力的、半衰期长的新型t-PA药物，以达到应用临床、治疗疾病的目的。为提供一种可产业化的利用转基因动物生产组织型纤溶酶原激活剂突变体的方法，本发明的发明人采取了以下技术方案。
本发明还包括从奶山羊分别克隆出β-酪蛋白5’调控序列和3’序列，构建成随机整合载体构建、显微注射和经精子转移制备转基因羊。首先用奶山羊的β-酪蛋白5’调控序列和3’序列构建成pGBC载体，然后在pGBC上连接ploxP-neo，以便用于转染羊胎儿成纤维细胞后的筛选。然后在β-酪蛋白的ATG前插入目的基因t-PAm，达到利用山羊奶蛋白β-酪蛋白的调控序列调控t-PAm在转基因山羊的乳腺表达的目的。
本发明的发明人还在克隆奶山羊β-酪蛋白基因序列的基础上，对t-PAm基因突变体进行亚克隆，并在起始密码子ATG前引入碱基突变形成ClaI酶切位点。然后将t-PAm基因和β-酪蛋白基因5`端和3`端序列插入到pLoxPneo通用打靶载体中。从而构建了含有β-酪蛋白基因5`调控序列、3`终止序列、pCMV-neo标记基因和pSV40-tk标记基因的打靶载体pGBC4-tPAm。该载体可用NotI内切酶进行线性化，然后用于细胞转染，该载体全长16.8kb，其中同源臂总长8.7kb。
手术取出关中奶山羊妊娠35天的胚胎，利用胰酶消化法制备山羊胎儿成纤维细胞，在5％CO2和37℃条件下培养。
含t-PAm随机整合表达载体电击转染山羊成纤维细胞，在G418培养基条件下培养，得到存活的细胞克隆，提取基因组DNA后PCR扩增t-PAm全长检测，获得克隆阳性细胞，其生长良好阳性细胞用于核移植。
含t-PAm的打靶载体经电穿孔法和脂质体法转染成纤维细胞，并用含G418和GANC的细胞筛选培养液培养。转染12天后开始挑选抗性细胞克隆。利用PCR和Southern杂交等方法鉴定转染阳性细胞。其中，用P1和P2引物进行第一轮PCR筛选，用P3和P4引物进行第二轮PCR筛选。用探针1和探针2分别进行两轮Southern杂交鉴定，以筛选中靶细胞克隆。
采集屠宰山羊卵巢卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，进行卵母细胞培养，通过显微操作去除位于第一极体处的中期染色体和部分细胞质。去核卵母细胞作为核移植受体细胞。用细胞质内直接注射法将中靶细胞核移植到去核MII期卵母细胞卵周隙中。对卵母细胞和供核细胞复合体做短期恢复培养后移入电融合液中进行电融合。融合胚经激活后体外培养，培养至桑葚胚或囊胚时期仍然发育良好的胚胎移植到同期发情羊的子宫中，以获得转基因克隆羊(详细过程见附图4)。
利用基因打靶与核移植技术，本发明可得到在β-酪蛋白基因座上定位整合t-PAm基因的转基因克隆山羊。
生产的人组织型纤溶酶原激活剂突变体为522个氨基酸的蛋白，其氨基酸序列见序列表1。用于调控t-PAm在山羊乳腺表达的β-酪蛋白5’端序列见序列表2。
图1随机整合载体1示意2体细胞基因打靶载体示意3随机整合载体2示意4转基因羊制备示意5卵母细胞体外成熟培养、核移植过程和胚胎体外培养图6阳性细胞与个体鉴定所用引物、探针的位置具体实施方式
材料和方法1、试剂与培养基所有试剂购自Sigma-Aldrich公司；所用内切酶、分子生物学方面的试剂购于Promega公司；培养基购自Gibco公司。
2、随机整合载体构建通过山羊的同源序列合成PCR引物，分段克隆关中奶山羊β-酪蛋白基因5’端调控序列，总长度为6200bp，3’端为第7外显子终止密码后6Kb，5’端和3’端引入酶切位点，并在5’端前引入2.4Kb的两个β球蛋白绝缘子序列，构建成pGBC载体，将3’端后面位点切开，Klenow酶补平并脱磷处理。将pLoxP中的Xhol位点切开，补平后自连，以去掉Xhol位点。然后将ploxP-neo用Not1和Sal1切下，平端处理后与pGBC载体连接。将改构后的pGBCN载体中的Xhol位点切开，补平并进行脱磷处理。将突变体t-PAm DNA用Kpn1和HindIII切下并处理为平端，连接到改构后的pGBCN载体上。并通过EcoR V酶切、PCR对其是否连入以及连入的方向性进行鉴定，从中筛选出了一个正向连接的阳性克隆，测序显示正确无误。这一表达载体命名为pGBCN-tPAm(见图1)。这一载体的3’端也连接了neor基因，能用于随机整合山羊成纤维细胞的筛选。
3、打靶载体构建将克隆关中奶山羊β-酪蛋白基因5`调控序列，总长度为6200bp，与ptPAm利用ClaI酶切位点进行连接。分别克隆了关中奶山羊β-酪蛋白基因第7外显子和第8、9外显子，GBC5-tPA连接获得pGBC5-tPAm-EX7，pEX8-9和ploxP，连接获得ploxP-EX8-9。把GBC5-tPAm-EX7切下插入到ploxP-EX8-9中，获得pGBC4-tPAm。该载体可以用NotI位点进行切割，用于细胞的定点整合。
将改构的质粒ploxP-1中的tk基因切下，与pBC3-neo连接，获得质粒pBC3-neo-tk。pBC5-tPA与pBC3-neo-tk的连接，获得质粒pGBC2-tPAm。该载体可以用NotI位点进行切割，删除掉原核序列，用于细胞的随机转染。
4、从屠宰场取到的卵巢获取卵母细胞采集屠宰山羊卵巢表面直径为1-5mm卵泡中的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，在体视显微镜下分级收集，A级和B级的COCs在D-PBS中洗涤3次。30mm培养皿中以100-200枚/3ml D-M199培养液中成熟培养。5％CO2，38.5℃和饱和湿度条件下成熟培养18-24小时后，放置D-PBS(0.2％透明质酸酶)中去除成熟卵母细胞表面的卵丘细胞，并洗涤。将脱掉卵丘细胞的卵母细胞放置于体视显微镜下检查第一极体的排放。选择排放第一极体的卵母细胞在室温下放置30min后，在M2培养液中短期培养后，去核前移入CB+M2培养液中，在显微镜下将位于第一极体处的中期染色体和部分细胞质去除。去核细胞洗涤后培养1-2小时，以作为核移植受体细胞。
5、山羊胎儿成纤维细胞的分离与培养；取受精后35天的山羊胚胎，将胚胎组织剪成小块，用含0.25％胰酶和1mM EDTA的PBS在37℃培养30分钟，分散细胞。然后用含10％FBS的DMEM培养基(GIBCO)洗一次。在5％CO2和37℃条件下培养，用10％FBS的DMEM高密度地培养胚胎成纤维细胞用于转染或冷冻保存。当大量细胞生长扩散后开始换液，以后每3-5天换液一次。当细胞铺满培养瓶底面时，用含胰蛋白酶和EDTA的PBS消化液消化细胞。消化后用吸管吹打使其快速悬浮，悬浮液离心后用培养液洗涤细胞沉淀，并继续接种，进行传代培养。
核供体细胞培养到长满，不补充培养基继续培养16天。培养3天时，用增殖细胞核抗原(PCNA)检测仍为阳性，10天后检测为阴性，继续培养6天，细胞进入G0期。用Giemsa染色确定每一细胞的正常核型。
6、电击转染按常规复苏胚胎成纤维细胞，培养3-5天。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，用10％FCS的DMEM培养基洗一次，用Hepes缓冲盐水悬浮细胞，计数细胞，取107细胞，1000RPM离心，去上清。用0.8ml含有0.5pmol/ml载体DNA的Hepes缓冲盐水悬浮细胞。转移细胞悬浮液到电击池。电击条件240V、600μFD。电击后的细胞分散到96孔板上，用无选择剂的10％FCS DMEM培养基培养。培养24小时后，随机整合细胞筛选使用含G418的培养基；打靶细胞筛选换成G418和GANC筛选培养基培养。培养12天后开始挑选克隆，一传三复制。一块用于PCR筛选和DNA提取；两块用于保存。保存方法用0.05％胰蛋白酶消化，冻存在50μl冻存液内，细胞数大约为1000-2000。
用表达Cre重组酶质粒pCMV-Cre脂质体法转染中靶细胞克隆，挑选抗性基因删除的细胞克隆进行增殖。提取基因组DNA，PCR鉴定，并且进行酶切消化后Southern杂交，筛选正确打靶的细胞克隆。
7、随机整合和中靶细胞的核移植及培养发育中靶成纤维细胞在核移植前在含0.5％FBS的DMEM培养液中培养2-10天。核移植前用0.25％胰蛋白酶消化，消化的细胞洗涤后放置于H-M199中。核移植前将供核细胞加入到含10％PVP注核液中，注入前用注核针抽吸供核体细胞使其破膜形成核胞体。每一去核卵母细胞中注入一个核胞体，完成后立即洗涤细胞并继续培养。
8、移植核的活化重构胚胎体外培养3-6小时后，用离子酶素激活4-5min，立即放入6-DMAP培养液中培养3小时，然后转入mCR1aaBSAFBS中与卵丘细胞单层共培养。将激活的胚胎在5％CO2，38.5℃和饱和湿度条件下培养，培养液为mcR1aaBSAFBS。培养48小时后检查胚胎卵裂率，培养到第9天检查囊胚发育率。培养期间每隔48小时半量更换培养液。
9、重构胚的胚胎移植培养至桑葚胚或囊胚时期仍然发育良好的胚胎移植到同期发情羊的子宫中，以获得转基因克隆羊。
10、PCR和Southern印迹鉴定方法提取细胞DNA或采取羔羊的耳组织，用组织DNA提取试剂盒，提取DNA。以基因鉴定引物P15`-CTAATTCCATCAGAAGCTGACTCTAGC-3`；P25`-AGAATCTGAGAAAGACTCTGATGCTGG-3`
P35`-GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3`P45`-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3`进行PCR，出现PCR产物者为阳性动物；分别用Eco81I，Bst98I等酶切电泳后做Southern印迹和杂交。
11、t-PAm的表达量和活性进行检测利用纤溶蛋白-琼脂糖-平板法，有活性的tPAm能激活纤溶酶原成为纤溶酶，纤溶酶能消化琼脂糖平板上的纤溶蛋白形成透明圆圈。通过与标准t-PAm纤溶活力的对比就可以测定t-PAm的表达量。
利用western blot进一步分析和鉴定t-PAm的活性。
12、生理生化检查对检查阳性的羔羊，进行生理生化检查，判断其健康情况。
结果1、pBCN-tPAm载体的构建。在pGBC载体上连接ploxP-neo用于将来转染羊胎儿成纤维细胞后的筛选。将改构后的pGBCN载体中的Xhol位点切开，补平并进行脱磷处理。将突变体t-PAm DNA用Kpn1和HindIII切下并处理为平端，连接到改构后的pGBCG载体上。并通过EcoRV酶切、PCR对其是否连入以及连入的方向性进行鉴定，从中筛选出了一个正向连接的阳性克隆，测序显示正确无误。并且试验显示可用Sal1和AatII切去原核序列。这一表达载体命名为pGBCN-tPAm(图1)。
2、t-PAm表达载体的转染将pGBCN-tPAm载体线形化，经电击转染成山羊胎儿纤维细胞，得到了多个存活的细胞克隆，最终数十个细胞克隆能大量扩增，提取基因组DNA后PCR扩增t-PA全长检测，24个细胞克隆阳性，其中10个PCR和Southern blot检测阳性，用于核移植。
3、基因打靶载体的构建利用关中奶山羊基因组DNA进行PCR扩增得到山羊beta-casein基因5’端调控区和外显子7-9序列。按图2构建基因打靶载体。
在这一载体中的5’端同源臂序列长度为6.3kb、3’端同源臂序列2.4kb。在3’同源臂后连接有tk基因。其中还包含t-PAm cDNA，1.7kb。抗性基因为pCMV调控的neor，位于第7内含子内。pGBC4-tPAm载体全长16.8kb。该载体可以利用NotI酶切线性化，用于基因的定位整合。
另外构建载体pGBC2-tPAm。5’端调控序列长度为6.3kb、3’端序列7.1kb。在3’端后连接有增强子序列。其中还包含t-PAmcDNA1.7kb。抗性基因为pCMV调控的neor，位于tPAcDNA后反向连接。PGBC2-tPAm载体全长26kb。该载体可以用NotI位点进行切割，删除掉原核序列，用于细胞的随机转染(图3)。
4、细胞转染与鉴定复苏胚胎成纤维细胞，培养3-5天后用于基因打靶。打靶后的细胞培养在10％FCS DMEM培养基中24h，然后换成含G418和GANC的培养基。培养12天后，一传三复制。按图6的部位序列设计两对引物，进行PCR，其产物长度与设计长度一致者为阳性。P1与P2引物扩增产物为2.4kb，P3和P4引物扩增产物为1.7kb。
PCR鉴定为阳性的细胞克隆，继续进行Southern blot试验，分别用Bst98I和Eco81I酶细胞DNA，用图6标示部位的序列作探针，其显影片段与理论推测一致的细胞为基因打靶阳性细胞，将其扩增，冻存备用。
5、核移植和胚胎的体外培养采集屠宰山羊卵巢获取卵母细胞并体外成熟培养，培养液为M199、10％FCS、FSH、LH和EGF(SIGMA)等，卵母细胞成熟培养24h后去除卵丘细胞，经去除第一极体和原核的MII期卵母细胞用做核受体。经0.5％FBS饥饿2-5d的转基因体细胞用做核供体。核移植后的重构胚在0.28M甘露醇、0.1mM MgSO4和0.05mM CaCl2电融合液中1.2kv/cm 40μs电击一次。30分钟后检查融合情况，融合胚用5μM ionomycin处理5分钟，2mM 6-DMAP处理4h。然后转移到CR1aa培养液中与单层卵丘细胞共培养，36h后检查卵裂情况。
手术法将发生卵裂并形态正常的转基因克隆胚(2-细胞期以上)移植到同期发情处理的山羊输卵管中(见图4)。受体山羊手术后观察其返情情况，2个情期内没有发情的视为妊娠。
6、受体山羊制备和胚胎移植受体山羊为文登奶山羊。受体山羊在胚胎移植前15天注射PG进行同期发情处理，发情的受体山羊埋植阴道拴，在胚胎移植前2天撤栓，受体山羊次日发情，发情的第2天进行克隆胚胎的胚胎移植。移植的胚胎处于2-或4-细胞期(图5)，通过输卵管伞进行移植到黄体发育好的一侧的输卵管中或双侧输卵管中，单侧移植8-10枚胚胎或每侧移植4-5枚胚胎。
7、新生羔羊的鉴定采取克隆羔羊的血液或取耳组织，提取DNA，作为模板，如图3用两对基因鉴定引物进行PCR，扩增片段长度与预期结果相同者为阳性。对PCR阳性羔羊的DNA酶切后进行Southernblot试验，用鉴定细胞(见图6)相同的探针杂交。杂交阳性者应有10.8kb的条带。
8、产物的鉴定当转基因克隆羊性成熟并能繁育后代后进行配种，产生后代后对其乳汁进行t-PAm活性检测。由于山羊乳腺原本不表达t-PAm，所以可以进行tPA的纤溶试验和Western blot分析。另外，采用酶切肽图和质谱分析，进一步鉴别t-PAm的结构和功能。
人组织型纤溶酶原激活剂突变体(t-PAm)氨基酸序列<110>OrganizationName中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所Application Project-------------------<120>Title用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>522<212>prt<213>
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山羊b-酪蛋白5’端DNA序列<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法<130>
<140>
<160>1<211>6212<212>DNASequenceName山羊b-酪蛋白5’端序列Sequence<400>1gcaaggagag aaaagaaagc cttcctcact gattaatgca aagaaataga ggaaaacaat 60agaatgggaa agactagaga gctcttcaag caaattagag atatcaaggg aacatttcac120gcaaagatgg gcacaataaa ggacagaaat tttatggagg agttgctgat ggagagggag180gcctggcgtg ctgcgattca tggggtcgca aagagtcgga cacaactgag cgactgaatt240gaactgaact gaactggaca aagcagaaga tattaagaag aggtggtaag aatacacaga300agaacaatat aaaaaagatc ttcatgaccc agataaccac gatgatgtga tcactcacct360agagccagac accctggaat gcaaagtcaa gcggccttag aaagcctcac tatgaacaaa420gctagtggag gtgatggaat tccagttgag ctatttcaaa tcttaaaagg tgatgctgtg480aaagtgctgc actcaatatg tcagcaaatt tggaaaacta agcggtggcc acaggactgc540cacaatccca aagaaaagca atgacaaaga atgttcaaac acccacatga ttgcactcat600ctcacatgct agcaaaataa ctctcaaaat tctccaagcc aggcttcaac agtacgtgga660ccatgaactt ccagatgttc aagctggatt tagaaaaggc agaggaacca gagatcaaat720tgccaacatc cattggatca tcaaaaaagc acgagaattc cagaaaaaca tctgctttat780tgactacgct aaagcctttg attgtgtgga tcacaataaa ctgtggaaaa ttctttagga840gatgggaata ccagaccact ttacctgcct cctgagaaat ctgtatacag gtccagaagc900agcagttaga actggacatg gaacgacaga ctggttccaa actgcgaaag gggtacatca960aggaatattc attggaagga ttgatgctga agctgaaact cctatacttt ggccacctaa 1020tgtgaagatc tgactcattg gaaaggactc caatgctggg aaagattgaa ggcaggagaa 1080gaggatgaca gaggatgaga tggttggatg ggatcactga ctcaatggac atgagtttga 1140gtaagctcca ggggttggtg gtggacagga aagcctggcg tgctgcagtc cacaaggtca 1200caaagattcg gacatgactg agtgactgaa ctgatactga tgtgctcaac aaatgtatct 1260tgaacttgtg tgaagttcta tggtcacatg taaaggaaga ataatcagga ttagctgtgt 1320gtcttatgaa tcagggttct gagttttatg tgttcatagt atctgctggt tcacaaaaca 1380tttttcttat tctctggttc ttgatttact ttataaagta atcttaatag ttatacttca 1440catagatagg aaattattat atttggataa tctcatggaa aggattaaat actccatcta 1500tacgagtaat gctgaactat ctactcctac ctaataattt gtcagaattc actaattctg 1560tgttatattg tttctaaatc tgaatcatta tatgaatcct cagtattttg ttttccttcc 1620tctatatttt ggaatttatt aaacagtgct tcaaataatt tttaggaaac tgaagttttt 1680agtaacagct ctatctctaa atagctttag tatcttgaaa aagtaataca aattctcaca 1740tccttaattt cctcttctct aaaatatctt taaaatattc tatgaatgat atctcttaat 1800atttattttt ttggcaatcc aacacagctt atgggatctt agttccccag tgaaggatta 1860tatccatgcc aactgcaatg aaagtacaaa atcctaaact ggactcacca gggatttccc 1920aatatctcct ctagttctta tttctgaata tttttggtcc ctttattgta ctcttcatcc 1980aacttttcta ttgatttctt tcttgaggat attatttact tggtttcagc tagaaatata 2040tgcaaatctc aggactgcat atttaagatt cattggccaa tatgggaaaa aacctttggc 2100tgaacaaatc atgcttataa aaaatagtac tagagcatct tactttgact atatcttgct 2160cctcattcag ggttatctaa tacaatttcc ccatatgaaa ttcttttgca ttataaaaat 2220ggaagctctt aggtaacatt gcaaaaattc gagttgctca tatggcactt tgcttcttac 2280tggtcattgt gttccgaggc ttacctggac agtggtacct gatgtcatct taaattgctg 2340gctttttgat tttccattgg ataagcttct ttctttagta tattgttaag gatttccttg 2400atcgagattt tacctacttt tctggtccaa ttggtgagag acagtcataa ggaaatgctg 2460
山羊b-酪蛋白5’端DNA序列tgtttattgc acaatatgta aagcatcttc ctgagaaaat aaaagggaaa tgttgaatgg2520gaaggatatg ctttcttttg tattcctttt ctgagaaatc agactttttc acctgtggcc2580ttggccacca aaagctaaca agtaaaggca tatgaagtag ccaaggcctt ttctagttat2640atctatgaca ctgagttcat ttcatcattt attttcctga cttcctcctg ggtccatatg2700agcagtctta gaatgaatat tagctgaata atccaaatac atagtagatg ttgatttggg2760ttttctaagt caatccaaga cttgtatgac agtaagatgt attaccatcc aacacacatc2820tcagcatgat ataaatgcaa ggtatattgt gaagaaaaat ttttaattat gtcaaagtgc2880ttactttaga aggtcatcta tctgtcccaa agctgtgaat atatatattg aaggtaatga2940atagatgaag ctaaccttgt aaaaatgagt agtgtgaaat acaactacaa ttatgaacat3000ctgtcactaa agaggcaaag aaacttgaag attgcttttg caaatgggct cctattaata3060aaaagtactt ttgaggtctg gctcagactc tattgtagta cttagggtaa gaccctcctc3120ctgtatgggc tttcattttc tttcttgctt ccctcatttg cccttccatg aatactagct3180gataaacatt gactataaaa gatatgaggc caaacttgag ctgtcccatt ttaataaatc3240tgtataaata atatttgttc tacaaaagta ttatctaaat aaatgttacc ttctgtctta3300aaatccctca acaaatcccc actatctaga gaataagatt gacattccct ggaatcacag3360catgctttgt ctgccattat ctgacccctt tctctttctc tcttctcacc tccatctact3420cctttttcct tgcaattcat gacccagatt cactgtttga tttggcttgc atgtgtgtgt3480gctgagctgc gtctgactgt tatcaacccc atgaatgata gtccaccagg ctctactgtc3540catgaaattt tccagtcaag aatactggag tggattgcat ttcctactcc atttgattaa3600tttagtgact tttaaatttc tttttccata ttcgggagcc tattcttcct ttttagtcta3660tactctcttc actcttcagg tctaaggtat catcgtgtgc ttgttagctt gttactttct3720ccattatagc ttaagcacta acaactgttc aggttggcat gaaattgtgt tctttgtgtg3780gcctgtatat ttctgttgtg tattagaatt taccccaaga tctcaaagac ccactgaata3840ctaaagagac ctcattgtgg ttacaataat ttggggactg ggccaaaact tccgtgcatc3900ccagccaaga tctgtagcta ctggacaatt tcatttcctt tatcagattg tgagttattc3960ctgttaaaat gctccccaga atttctgggg acagaaaaat aggaagaatt catttcctaa4020tcatgcagat ttctaggaat tcaaatccac tgttggtttt atttcaaacc acaaaattag4080catgccatta aatactatat ataaacagcc gctaaatcag atcattatcc attcagcttc4140tccttcactt cttctcctct actttggaaa aaaggtaaga atctcagata taatttcagt4200gtatctgcta ctcatcttta ttttggacta ggttaaaatg tagaaagaac ataattgctt4260aaaatagatc ttaaaaataa gggtgtttaa gataaggttt acactatttt cagcagatat4320gttaaaaaat agaagtgact ataaagactt gataaaaatt atagtgactg caaatgtttt4380aggaatataa taagatataa taacagtggt tgctattttc tttagcacaa gactagtcaa4440caggctgtat taaaagatct tttcttgaat taaatatttt caatttgatt aaacctacct4500cagccataaa ggcaagcaca tttcatttat actatgggga tttgaataat tattactgaa4560gaagccctac caacaaaaag tttatagagc tatcatattt agtcaagaga taaagagggt4620tgttaggata tatatgctat ttgaaaggta tttataaaag aagagtatat ttatcaaaat4680ttctcagaac atccaaattt caagtttatc atttatctta caatatttca aaaatattaa4740aatagataca tgaaatacag aagtaaatta aagagaaagt attttacttg gtaaaaaaat4800tctaggttgg acagagagtg ccaggaaaca aaaacaatga aaaatgtgac ctgacaggaa4860ttatagctca aagtatagta gtaagtaatg aaatggctta aaaattggta tataaaatgc4920tagttataaa ataaacaaaa tgcaataata tcctccctac atgtaatgaa ttctaggtat4980tatgctcttt tttgaagtct tgacaataaa aattttttta gaagtttata ggcatcttga5040ataaagtgaa acaaattaag aattagtatc catgagaaaa atatagaaca gattttccta5100atttagtttg aaaatctggg attgaagatg tgtgtcaaga gatgttggtg gcaagaacat5160ttttttttca agaacttata aaaatgcaac aaaacaaacc atttaataca ttttggtcaa5220aatcaataat gtattttatt ttatgctcca aggagcataa aattggggac tgggcaagag5280aaactgacac cctggtaaat taccaagaga taagtacaca gttctatgta gagaaaataa5340gcatagtgta tgatctctaa aattatgtga gacaaaggag agatgacatt aggcatgtgg5400ggatgaagac tgagtagaga agaaacaatc taatcagtcc aagaaaacat ctcgatcagt5460ggaacaaata gaagaaatgc taaaatgaaa cagaagtctt actggaaata aaagatatgc5520ataagacaaa aattcatgaa aatcacttag tttagcagag aaaagataaa aataaagtat5580gaccttcttc atatacattg tttgatcata tgcacctcaa taaaactgag tctccaacag5640aaatgaaaca ttaatatttt gttcactgct ctaatcccag aatctaagcg atatctggca5700ataaaaataa taaatatata ttttttaata aatgaatcaa ccacttaatt tttctgtaaa5760tatctgtaac ttctcttctg tctttccaaa aacacccata agtactgtga atgagatgaa5820
山羊b-酪蛋白5’端DNA序列aaagagtgaa gtaggatata ggctgttagc agaaaacatc tgaatggctg gcagtgaaac5880attaacttga aatgtaagat taatgagtaa tagtaaattt taaccttggc catatgataa5940aatgttcatt aatatttttc tagaatacag ggctttttgt ttttgccatg aggtttgcag6000gatcttggtt ccctgaccag ggatcaaacc tgcactcccc tggaagcatg gagtcttgga6060catctgtatt atacactatc tttggttcct tttaaaggga agtaatttta cttaaataag6120aaaatagatt gacaagtaat acgctgtttc ctcatcttcc cattcacagg aatcgagagc6180catgaaggtc ctcatccttg cctgtctggt gg 621权利要求
1.利用核移植制备产组织型纤溶酶原激活剂突变体转基因山羊的方法，包括以下步骤(1)奶山羊的β-酪蛋白基因5’端和3’端序列克隆与鉴定；(2)随机整合山羊细胞的乳腺表达载体的构建；(3)基因打靶载体的构建；(4)分离培养奶山羊胎儿成纤维细胞；(5)转染奶山羊胎儿成纤维细胞；(6)随机整合与同源重组的细胞鉴定；(7)核移植和胚胎的激活与体外培养；(8)转基因山羊及乳腺表达产物的鉴定。
2.权利要求1所述的生产人组织型纤溶酶原激活体突变体的方法，其特征在于包括以下步骤(1)从奶山羊的组织DNA中克隆β-酪蛋白基因5’端和3’端序列，并进行序列分析；(2)使用的人组织型纤溶酶原激活体突变体为中国发明专利(ZL93109234.5)保护产品，插入到奶山羊的β-酪蛋白基因翻译起始位点，构建完整的基因打靶载体和随机整合载体；(3)分离奶山羊胚胎成纤维细胞，进行体外培养，将(2)所述两种载体分别导入到奶山羊成纤维细胞中；(4)确证奶人组织型纤溶酶原激活体突变体插入在细胞的β-酪蛋白基因中和检测随机整合载体整合在细胞里；(5)将已鉴定的奶山羊成纤维细胞的核移植到去核奶山羊卵中；(6)通过激活和体外培养后，选择成活的移核胚移植到代孕山羊的输卵管；(7)对出生的小羊进行基因分析和鉴定；(8)对性成熟的转基因奶山羊交配受孕和后代繁殖，测定人组织型纤溶酶原激活体突变体的表达。
3.利用奶山羊的β-酪蛋白基因构建的随机整合和打靶载体。
4.利用3项的载体制备转基因动物和在转基因山羊乳腺表达的人组织型纤溶酶原激活体突变体(t-PAm)。
全文摘要
利用山羊奶蛋白β－酪蛋白的调控序列调控改构的人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因(t－PAm)在转基因山羊的乳腺表达。构建随机整合载体(pGBCN－tPAm和pGBC2－tPAm)和β－酪蛋白基因打靶载体(pGBC4－tPAm)。在构建中利用了来自关中奶山羊的β－酪蛋白调控序列和3’端序列，考虑到用于细胞转染，在载体的3’端也连接了neo
文档编号C12N15/12GK1659959SQ20041000455
公开日2005年8月31日 申请日期2004年2月24日 优先权日2004年2月24日
发明者沈伟, 杨正田, 邓继先, 潘庆杰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所