专利名称：抗人乳头状瘤病毒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及登革热病毒，具体来说是以HPV特异性抗原取代登革热病毒的结构蛋白基因的重组疫苗，及其制法和用途。
背景技术：
癌症是严重威胁人类生命的疾病。许多癌症的发生与病毒有关。以宫颈癌为例，人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染可以导致生殖道性病及癌症已得到公认。HPV感染率及感染程度随宫颈病变程度的加重而逐渐升高，可简要描述为慢性宫颈炎→假性湿疣→疣样病变→尖锐湿疣→宫颈上皮内瘤样病变→宫颈癌。HPV具有广泛的感染人群，我国妇女的感染率为10-40％，欧洲妇女的感染率高达40-60％。在女性中宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌。据世界卫生组织统计，全球现有宫颈癌患者约170万，每年约50万新发病例，20多万死亡病例。我国现有宫颈癌患者约14万，每年新增病例约4万。75％以上的宫颈癌病例与两种类型(16和18型)的HPV感染有关。临床上多采用放疗、手术和化疗治疗宫颈癌，少数结合中医中药治疗，但效果并不理想。宫颈癌患者的5年存活率是65％。宫颈癌的复发率较高，复发病例的预后差，2年存活率只有5％。在美国，每年用于宫颈癌筛查和治疗的费用约为5.7亿美元。
治疗恶性肿瘤最常用的手术、化疗和放疗三大传统疗法存在着复发率高、副作用大及产生耐药性等缺陷。肿瘤的生物治疗，尤其是肿瘤免疫治疗或基因治疗，因其理论上的高特异性及低副作用，作为治疗肿瘤新的模式，其战略地位已逐步确立，但至今临床应用效果与人们的期望仍有很大差距。
现有技术中的疫苗包括以下几种死疫苗这是人类早期试验的肿瘤疫苗，其特点是比较安全，但是因为诱导细胞免疫需要抗原在活细胞内表达及提呈，因此其不能引起有效的细胞免疫。
以病毒为载体的疫苗DNA病毒载体内保留完整的DNA复制系统，是一种活疫苗。它能有效地复制和表达癌基因片段，能不断地刺激细胞免疫系统，产生细胞毒性T细胞(Cytotoxic T cells，CTLs)对抗肿瘤。但是为了避免致癌的可能性，一般采用癌基因片段为抗原，这样抗原性就降低。但这种DNA病毒疫苗安全性低。
Borysiewicz LK等(Lancet.1996 Jun 1；347(9014)1523-7.)公开了一种以牛痘病毒为载体的HPV疫苗，但是由于许多人都携带牛痘病毒的抗体，因此限制了该疫苗的适用范围，而且这种牛痘病毒疫苗难以进行重复免疫。
WO0153467公开了一种重组黄病毒，其中包括可编码外源氨基酸序列的外源核苷酸序列。用重组黄病毒感染宿主细胞，可在宿主细胞中提供外源核酸，并产生由外源核酸编码的抗原性多肽，进而引发对外源多肽的免疫应答。然而，其缺点是使用了可自主复制增殖的黄热病病毒，保留了全部的黄热病病毒基因组序列，没有结构蛋白基因的缺失。虽然构建疫苗时无需包装系统，但是安全性较低。
抗原提呈细胞制备肿瘤疫苗制作的基本方法是首先从患者身上取得树突状细胞，进行原代细胞培养与扩增，再用肿瘤相关抗原或特异性抗原体外处理自体树突状细胞，再接种到宿主，使其在体内激活T淋巴细胞，起到治疗和保护作用。然而这种方法费时费力，成本高，树突状细胞的培养、扩增与激活成功率低，难以实现质量控制。因此这种完全个体化定制肿瘤疫苗的方法无法产业化，难以推广应用。
综上所述，本领域迫切需要开发新的安全性好、免疫效价高、重复免疫效果好的疫苗。
发明内容
本发明的目的就是提供一种新的安全性好、免疫效价高、且重复免疫效果好、适于产业化生产的疫苗，尤其是抗肿瘤和的疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种登革热病毒重组复制子，所述的复制子缺失了登革热病毒preM蛋白的全部编码序列，并且包括以下元件a)全部的5’端的非编码区；b)C蛋白前20个氨基酸的编码区；c)NS1蛋白信号肽的编码区；d)所有的非结构蛋白编码区；e)3’端的非编码区；f)位于b)和c)之间的外源核酸序列，所述的外源核酸序列编码HPV抗原、免疫调节因子或HPV抗原与免疫调节因子复合物。
在另一优选例中，所述的外源核酸序列的3’端具有3’端释放元件，或者NS1蛋白信号肽的编码区前具有5’释放元件，所述的释放元件选自SEQ ID NO3所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO44所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合。
在另一优选例中，所述的登革热病毒为登革热病毒I、II、III或IV型，或其组合。
在另一优选例中，所述的NS1蛋白信号肽的编码区是E蛋白基因的最后72个核苷酸。
在另一优选例中，所述的HPV抗原是HPV的E7-E6片段，例如16亚型和18亚型的HPV的E7-E6片段。
在本发明的第二方面，提供了一种假病毒颗粒，它由上述的登革热病毒重组复制子和登革热病毒结构蛋白包装组成。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有上述的登革热病毒重组复制子或假病毒颗粒，和药学上可接受的载体。
在本发明的第四方面，提供了本发明的登革热病毒重组复制子或假病毒颗粒的用途，用于制备治疗和预防以下疾病的药物肿瘤、病毒性疾病，尤其是HPV相关疾病如慢性宫颈炎、假性湿疣、疣样病变、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌。
在本发明的第五方面，提供了一种用于包装上述登革热病毒重组复制子的包装细胞，所述的包装细胞选自下组(i)被含有登革热病毒重组复制子缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞，(ii)被含有登革热病毒重组复制子缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和(iii)基因组整合有登革热病毒重组复制子缺失的结构蛋白基因的细胞，且所述的包装细胞能表达包装所述复制子所需的登革热结构蛋白，并且缺失的登革热结构蛋白基因在其中表达时，不影响细胞的生长特性。
在本发明的第六方面，提供了一种制备假病毒颗粒的方法，包括以下步骤(i)将权利要求1所述的登革热病毒重组复制子，或者含有所述复制子的假病毒颗粒，导入登革热病毒的包装细胞；(ii)当所述的包装细胞表达登革热病毒结构蛋白时，培养所述的包装细胞，从而产生登革热病毒的假病毒颗粒；或者，当所述的包装细胞不表达登革热病毒结构蛋白时，将辅助病毒复制子导入该包装细胞，其中所述辅助病毒表达登革热病毒的结构蛋白，然后培养所述的包装细胞，从而产生登革热病毒的假病毒颗粒；(iii)回收含有复制子的假病毒颗粒。
在另一优选例中，所述的包装细胞含有选自下组的登革热病毒结构蛋白表达载体含缺失NS3的登革热基因组序列的表达载体，受四环素调控的基因表达载体。
图1是显示了实施例4中方法1的制备过程示意图。
图2是显示了实施例4中方法4的制备过程示意图。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，建立了以登革热病毒为载体的假病毒颗粒疫苗技术，并成功地构建了安全性好、免疫效价高、可重复免疫的抗HPV的登革热病毒疫苗，在此基础上完成了本发明。
如本文所用，“nt”为核苷酸。
如本文所用，“释放元件”指位于抗原多肽编码序列元件3’端或NS1信号肽编码区5端的核酸序列，当翻译成蛋白质后，用于释放完整的、不含无关序列的抗原性多肽。优选的释放元件选自SEQ ID NO3所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO44所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合。释放元件通常为一个，但也可以是多个。
术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引发哺乳动物免疫应答的氨基酸序列，无论是单独或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。
本文所用的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作。
如本文所用，术语“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。
首先，本发明人经过大量试验首次证实了登革热病毒重组复制子的构建必须满足下列条件1.必须保留完整的非结构蛋白基因序列。任何对结构蛋白基因的切除，必须保证不影响原病毒非结构蛋白的表达，也不能造成非结构蛋白及其信号肽发生移码变异。
2.必须保留C蛋白基因的前60nt(即C蛋白前20个氨基酸的编码序列)，因为这段序列与5’-UTR和3’-UTR互补形成环形，是登革热病毒基因复制和病毒包装所必需的结构。当小于60nt，形成假病毒颗粒的效率会明显下降。虽然大于60nt时(如81，99，120，150，180nt)仍可形成假颗粒，但是所容纳外源基因的长度会相应下降，因此优选的范围是保留C蛋白基因的前60-150nt，更佳地前60-120nt。
3.必须保留完整的非结构蛋白NS1的信号肽，即E蛋白最后的24个氨基酸。相应的编码序列是E蛋白基因的后72nt。当小于72nt，形成假病毒颗粒的效率会明显下降，甚至不能形成假颗粒。虽然大于72nt时(如81，99，120，150nt)仍可形成假颗粒，但是所容纳外源基因的长度会相应下降，因此优选的范围是保留72-150nt，更佳地60-120nt。
4.结构蛋白基因的切除，以及在切除位点外源基因的插入，均不能影响NS1信号肽的功能。登革热病毒结构蛋白编码区包括CpreME。通常可缺失CpreME蛋白的部分编码序列(通常约100-2000bp，较佳地500-2000bp)，当然，尽可能地删去CpreME的编码区域是优选的。另一种优选方式是完全缺失preM，以提高安全性。
可用于本发明的登革热病毒没有特别限制，可以是任何一种亚型登革热病毒。4种亚型的基因组序列可见如下登录号I型 M87512II型 M29095III型M93130IV型 AF289029。
登革热病毒具有嗜树突细胞特性，可更有效地提高疫苗疗效，疗效更好。此外，登革热病毒特有ADE(antibody dependent enhancement of infection，抗体依赖性感染增强)现象，即第一次用登革热病毒免疫后，再次用不同亚型登革热病毒免疫时，抗体依赖性感染增强，从而可非常有效地进行重复免疫。ADE现象用于外源蛋白表达系统，不但可以避免重复免疫时机体对载体的中和作用，而且能提高载体进入细胞的效率，提高外源蛋白的投递效率。由于登革热病毒有4种亚型，以其作为外源基因的表达载体，可以通过接种不同亚型的重组登革热病毒复制子加强免疫。
可适用于本发明的外源基因没有特别限制，可以是任何肿瘤抗原基因、病毒抗原基因和免疫调节因子基因。代表性的抗原例子包括(但并不限于)人HPV抗原(如16亚型和18亚型的E6-E7片段)、HIV抗原、HBV抗原、HCV抗原、EBV抗原、HTLV-I抗原、MAGE、BAGE、CAGE等。通常外源基因的长度没有特别限制，通常约为100-2000bp，较佳地为150-1200bp。此外，为了便于将表达的抗原切下，可以在外源基因的3’端侧接释放元件(如2A序列)。当插入的抗原基因是肿瘤抗原基因或病毒抗原基因，本发明疫苗可以预防和治疗肿瘤及病毒性疾病。
以抗人乳头状瘤病毒疫苗为例，本发明提供了针对HPV感染所致疾病的预防性疫苗及治疗型疫苗，所述的疫苗包含由登革热病毒重组复制子和登革热病毒结构蛋白包装组成的假病毒颗粒，所述的登革热病毒重组复制子的外源核酸序列编码一种或多种HPV亚型的抗原蛋白，免疫调节因子或HPV抗原与免疫调节因子复合物，所述的HPV亚型的抗原蛋白可以为HPV 16亚型或HPV 18亚型的E6、E7、E7-E6癌蛋白或者为HPV主要衣壳蛋白L1、次要衣壳蛋白L2，所述的免疫调节因子可以为IL2、IL12、IL18、GM-CSF等。本发明提供的疫苗特别显示了治疗性疫苗的优势。抗人乳头状瘤病毒(HPV)的疫苗可以预防与治疗由乳头瘤病毒感染所致的疾病，如慢性宫颈炎、假性湿疣、疣样病变、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤样病变及子宫颈癌等。
在制备本发明的复制子时，通常可按以下步骤进行(1)构建全长的登革热病毒的基因组序列这可用常规的PCR和连接技术实现。
(2)缺失登革热病毒的部分结构基因这可以用同源重组实现，也可用人工全合成等方法实现。一种特别优选的方法在酵母中进行同源重组缺失。
(3)插入外源基因虽然可用一些常规方法将外源基因插入已缺失部分结构基因的区域，但是优选方法仍然是在酵母进行同源重组在外源基因的两端添加与待插入位点两侧序列同源的同源臂，然后将外源基因和缺失结构基因的登革热病毒基因组DNA同时引入酵母细胞，通过同源重组获得插入外源基因的复制子。这种方法的重组发生率接近100％，构建过程相对简单、可控、稳定。
在获得复制子后，可将其引入包装细胞，从而产生假病毒颗粒。一种常规方法是在将登革热病毒复制子引入细胞后，再引入表达结构蛋白的辅助病毒。另一种优选的方法采用了诱导表达的质粒或组成型表达的质粒作为登革热病毒结构蛋白基因的载体，构建诱导表达的包装细胞，然后将复制子(或假病毒颗粒)直接引入该该细胞，从而产生假病毒颗粒。例如，尤其是使用不表达NS3基因的组成型表达的包装细胞。NS3基因具有特殊的包装信号序列，不能将缺失NS3基因的登革热基因组包装入假病毒颗粒，因此当包装细胞没有登革热病毒的NS3基因，不能自我包装形成假病毒颗粒。用这种包装细胞得到的假病毒颗粒仅含有登革热病毒重组复制子，无需筛选。
具体地，优选的方法包括(a)当包装细胞含有受四环素调控的(或其它可调控表达方法)从而表达登革热病毒结构蛋白的基因表达盒时，将重组的登革热病毒RNA复制子导入包装细胞内，从而产生包括登革热病毒复制子的假病毒颗粒。
(b)将重组的登革热病毒复制子导入细胞内，培养一段时间(如24小时)后，将可表达所需登革热结构蛋白的甲病毒复制子(或其它表达载体)导入同一细胞，从而产生包括登革热病毒复制子的假病毒颗粒。
(c)当包装细胞表达切除部分NS3基因后的登革热基因组时，将重组的登革热病毒复制子导入包装细胞内，从而产生包括登革热病毒复制子的假病毒颗粒。
(d)用假病毒颗粒感染细胞，培养一段时间后，将可表达所需登革热结构蛋白的甲病毒复制子颗粒(或其它非复制型病毒载体)感染同一细胞。从而产生包括登革热病毒复制子的假病毒颗粒。
药物组合物本发明还提供了包含本发明的重组登革热病毒复制子和/或假病毒颗粒的各种组合物，包括药用组合物，尤其是疫苗组合物。这些组合物可用于预防和/或治疗HPV相关疾病如慢性宫颈炎、假性湿疣、疣样病变、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌。
包含本发明的重组登革热病毒的各种组合物可以包含按实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington药学和药学实践”，第19版(1995)Mack Publishing Co.。
可将药用组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂、和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，本发明的重组登革热病毒可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是药学上可接受的载体，也是本领域技术人员所熟知的)。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；Montanide ISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’sTiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu BiotechnikGmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分。
给药途径和剂量当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组登革热病毒复制子和/或假病毒颗粒施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，除有重组Dengue病毒以外，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。
给药的常规和药学上可接受的途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、阴道内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予登革热病毒重组复制子和/或假病毒颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效地促使保护宿主抵抗HPV病毒感染、肿瘤等症状。
在各疫苗剂份中所选用的登革热病毒复制子和/或假病毒颗粒的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1-1000μg，较佳地为1-200μg，更佳地10-100μg抗原蛋白质。以重组登革热病毒核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1-1000μg核酸。另外，疫苗的有效剂量的一般范围为约102-109，103-107或104-105空斑形成单位(PFU)。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
和已有技术相比，本发明具有以下主要优点1.提高了免疫的有效性(1)树突状细胞是最有效的抗原提呈细胞。在本发明利用登革热病毒具有嗜树突状细胞的特性，以登革热病毒重组复制子为载体，在上述被感染的细胞内高效率地表达并提呈抗原，从而激发机体针对抗原的有效免疫。
(2)利用不同型的登革热病毒可以重复感染的特性和ADE现象进行重复免疫，提高免疫效果。
(3)既是肿瘤抗原又是病毒抗原的基因E6、E7重组的登革热病毒复制子可以在细胞内较长时间地表达E6、E7抗原，有效地刺激免疫系统对抗原的免疫反应。
2.提高疫苗的安全性(1)登革热病毒复制子是从RNA病毒重组而来，复制子的复制和表达完全在细胞质内进行，难以把癌基因重组到人体细胞的染色体内。
(2)重组的登革热病毒复制子是去掉结构蛋白基因的重组登革热病毒RNA。只能在人体细胞中复制和表达，不能形成侵染性的病毒颗粒，不会对周围细胞进行二次感染。
(3)免疫系统具有对重组复制子的识别和清除的能力，复制子不会在体内长期存在，安全性好。
3.治疗痛苦小(1)给药次数少(2～3次)，减少治疗过程带给患者的痛苦。
(2)见效快，缩短了治疗疗程；4.生产成本低(1)以登革热病毒重组复制子转染可表达登革热结构蛋白的包装细胞产生假病毒颗粒，用假病毒颗粒再次感染包装细胞即可生产出大量假病毒颗粒，使假病毒颗粒的制备效率大大提高，同时避免了需要重复大量构建复制子，从而缩短了疫苗生产流程，提高了疫苗的生产效率，产品生产成本降低。
(2)以登革热病毒重组复制子转染不表达NS3基因的组成型表达的包装细胞，生产出假病毒颗粒。NS3基因具有特殊的包装信号序列，不能将缺失NS3基因的登革热基因组包装入假病毒颗粒，因此当包装细胞不能自我包装形成假病毒颗粒。用这种包装细胞得到的假病毒颗粒均含有登革热病毒重组复制子，无需筛选，提高了假病毒颗粒的制备效率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1全长的登革热病毒cDNA克隆的制备过程1.把全长的登革热病毒cDNA整合到pRS424质粒(Plasmid)内，制备全长的登革热病毒cDNA克隆。所述的登革热病毒II型NGC(ATCC#VR-1255)和pRS424质粒(ATCC#77105)，购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
a)用RT-PCR的方法把登革热病毒RNA转化成三段登革热病毒cDNA片段(5′端cDNA，3′端cDNA和中间段cDNA)，在5′端cDNA片段的5′端加上Xba I酶切位点和Sp6增强子序列；在3′端片段的3′端加上Sac I酶位点；中间片段的两头包括部分与5′端cDNA片段的3′端和3′端cDNA片段的5′端相同的基因序列。
所使用的DNA引物的序列如下
获得三个登革热病毒cDNA片段，长度分别为5484bp，2530bp和2922bp。
b)先把5′端片段，然后把3′端片段用传统连接的方法连接到pRS424质粒内。
c)利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，把中间片段插到上述克隆中，产生全长的登革热病毒cDNA克隆pRS/FLD2。
2.制备去除了登革热病毒结构蛋白的序列的登革热病毒复制子的cDNA克隆a)用BamH I内切酶在登革热病毒cDNA序列(Gene Bank登录号AF038403)的1696或者2203的位置上(登革热病毒基因上固有的BamH I酶切位点)把上述步骤1的c)中产生的全长的登革热病毒cDNA克隆pRS/FLD2切割成线性。
b)用Fusing PCR的方法，制备一段96碱基长的DNA片段，这个片段的5′端含有45个碱基对来源于结构蛋白的第六到第二十密码子；片段的3′端含有45个碱基对来源于结构蛋白的第751到第766密码子；这个片段的中间部位包括一个BamH I的酶切位点。所述的DNA片段的序列如SEQ ID NO5所示。
c)把线性的pRS/FLD2、96碱基长的cDNA片段和活化的酵母菌一起加入酵母菌转化液(PEG缓冲液)内，在摄氏30度保温一小时，线性的pRS/FLD2和96碱基长的cDNA片段能够自动转化到酵母菌内。在酵母菌培养基上培养两天以后，可以得到转化的酵母菌菌落。利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，96个碱基长的cDNA片段能够自动取代登革热病毒结构蛋白的序列(序列表SEQ ID NO4)，产生大量去除了登革热病毒结构蛋白的序列的登革热病毒复制子的cDNA克隆。(去除了登革热病毒结构蛋白的序列的登革热病毒RNA复制子和实施例3中产生的重组HPV登革热病毒RNA复制子一样，可用实施例4中的所有四种包装方法制备成登革热病毒RNA复制子假病毒颗粒，用作动物实验的对照。)实施例2制备HPV E7-E6-2A DNA片段(i)其中E7-E6序列是HPV的癌基因(Gene Bank登录号AF486352；AF469197；AF472508)，如SEQ ID NO1所示，编码256个氨基酸的抗原(SEQ IDNO2)。
(ii)所述的2A是口蹄疫病毒的基因片段，由六十个碱基组成，其基因序列如序列表SEQ ID NO3所示。
(iii)以HPV-16质粒(ATCC#45113D)为模板，分别以GCGAGAAATACGCCTTTCAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACATGCATGGAGATACACCTACA(SEQID NO12)和TGCAGTTCTCTTTTGGTGCATTGGTTTCTGAGAACAGATGGG(SEQ ID NO13)为一对引物；并以ATGCACCAAAAGAGAACTGCA(SEQ ID NO14)和AAGGTCAAAATTCAACAGCTGGGTTTCTCTACGTGT(SEQ ID NO15)为另一对引物，用PCR方法制备E6和E7 cDNA片段。E6 cDNA片段的5’端21nt与E7 cDNA片段的3’端的部分序列相同，E6 cDNA片段的3’端21nt与含2A的片断的5’端的部分序列相同，E7 cDNA片段的5’端部分序列与登革热II型病毒cDNA nt 108-124序列相同。以CAGCTGTTGAATTTTGACCTTCTTAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGCCCC(SEQID NO3)和ATACAGCGTCACGACTCCCACCAATACTAGTGACACAGACAGTGAGGTGCTGGGGCCAGGGTTGGACTCGAC(SEQ ID NO16)为引物，用融合PCR的方法制备一个111bp的含2A的片段其3’端部分序列与登革热II型病毒cDNA nt 2275-2325序列相同。
4.把E6 cDNA片段、E7 cDNA片段及含2A的111bp片段同时放在PCR反应管内为模板，以GCGAGAAATACGCCTTTCAATATGCTGAAACGCGAGAGAAACATGCATGGAGATACACCTACA(SEQ ID NO17)作为E7 cDNA片段的5’端引物，以ATACAGCGTCACGACTCCCACCAATACTAGTGACACAGACAGTGAGGTGCTGGGGCCAGGGTTGGACTCGAC(SEQ ID NO18)作为含2A的片段的3’端引物，用PCR的方法得到全长的E7-E6-2A cDNA片段，此片断的两端分别包含部分与登革热病毒cDNA基因相同的序列。
实施例3整合HPV病毒基因到登革热病毒RNA复制子的过程1.将实施例1的第1步骤c)制备的全长的登革热病毒cDNA克隆(简称pRS/FLD2)。用BamH I内切酶切开成线性。
2.将线性的登革热病毒cDNA克隆(pRS/FLD2)和HPV E7-E6-2A cDNA片段一同转化酵母菌(yeast)，在酵母菌的DNA复制的过程中，HPV E7-E6-2A cDNA片段能够自动整合到登革热病毒cDNA克隆中，并取代登革热病毒结构蛋白的基因序列(包括C编码区序列、M编码区序列和E编码区序列)，产生大量的环状的HPV-登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆(即pRS/D2-HPV16)。
3.将步骤2中产生的HPV-登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆用Qiagencolumn(QIAGEN Inc.)从酵母菌内纯化出来。
4.用酵母菌制备的HPV-登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆转化Stabl2TM细菌(购自美国Invitrogen公司)，大量的HPV-登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆可以用这个系统来制备。
5.用Sac I内切酶将HPV-登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆的3′末端切开成线性。
6.用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNA polymerase)把修饰后的HPV-登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆转录成RNA，即得到重组HPV登革热病毒RNA复制子。
7.用电击的方法(electroporation)，将重组HPV登革热病毒RNA复制子转染至宿主细胞BHK-21(Baby hamster kidney)(ATCC#CCL-10)内，重组HPV登革热病毒RNA复制子可在宿主细胞内复制并表达HPV的E7-E6蛋白。
实施例4HPV病毒疫苗的四套制备方法方法一利用四环素调控的基因表达系统制备疫苗方法概述利用四环素调控的基因表达系统，转化BHK-21(Baby hamsterkidney)(ATCC#CCL-10)，开发出一个能够被调控表达登革热病毒结构蛋白的细胞系。四环素调控的基因表达系统(Tet-Off Gene Expression systems购自美国Clontech公司)。这种质粒能够表达一种调控蛋白质，称为“四环素控制的逆激活蛋白”，该蛋白参与基因表达质粒转录的调控。这个基因表达系统包括pTet-Off调节载体(regulator vectors)，pTRE2反应载体(response vector)，pTK-Hyg选择载体(selection vector)。
1.将登革热病毒结构蛋白基因(完整的2328bp的登革热病毒结构蛋白基因)(序列表SEQ ID NO4)插入到四环素调控的基因表达系统的pTRE2反应载体。具体地说以全长的登革热病毒cDNA克隆(即pRS/FLD2质粒)为模板，以ATATCCCCGCGGATGAATAACCAACGAAAAAAGGCG(SEQ ID NO19)和ATATATCTAGACTAGGCCTGCACCATAACTCCCAA(SEQ ID NO20)为一对引物，用PCR方法制备CpreME cDNA片段。将CpreME cDNA片段和pTRE2(Clontech公司)用Xba I and Sac II进行消化。用Qiagen spin column(QIAGEN Inc.)对酶切产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(New England Biolab公司)连接，并转化至大肠杆菌内，从而克隆产生登革热病毒结构蛋白基因重组的pTRE2质粒。
2.用电击的方法把pTet-Off调节载体(regulator vector)转化到BHK-21细胞内，然后筛选得到BHK-21 Tet-off细胞株。
3.将步骤1中产生的插入登革热病毒结构蛋白基因的四环素调控的基因表达系统，用电击的方法转化至BHK-21 Tet-off(Baby hamster kidney)，得到可调节和高表达登革热病毒结构蛋白的BHK-21细胞株。
4.将实施例3中产生的重组HPV登革热病毒RNA复制子用电击的方法转化上述细胞株。一天后，四环素调控的基因表达系统诱导该细胞株高表达登革热病毒结构蛋白。十天以后，收集培养液上清，即可得到每毫升104包装过的重组HPV登革热病毒RNA复制子假病毒颗粒。
方法二利用Sindbis RNA复制子制备疫苗1.制备登革热病毒的结构蛋白基因片段a)以实施例1的第1步骤c)制备的pRS/FLD2为模板，以CCTCTAGCTAGAGCTTACCATGAATAACCAACGAAAAAAG(SEQ ID NO21)和GATTAGAGCTCTTATCTGCGTCTCCTGTTCAAGAT(SEQID NO22)为引物，用PCR的方法制备登革热病毒结构蛋白基因的C编码区DNA片段。
b)以实施例1的第1步骤c)制备的pRS/FLD2为模板，以GCGCTCTAGAATGACTGCAGGCATGATCATTATG(SEQ ID NO23)和ATGCCAGTAGGACAGGTGTAATCTAGGCCTGCACCATAACTCCCAA(SEQ ID NO24)为引物，用PCR的方法制备登革热病毒结构蛋白基因的preM-E编码区DNA片段。
c)以SindbisRNA复制子cDNA克隆(STRATAGENE公司)为模板，以ATTACACCTGTCCTACTGGCA(SEQ ID NO25)和CATGGTAAGCTCTAGCTAGAG(SEQ ID NO26)为引物，用PCR的方法制备Sindbis 26S DNA片段。
d)preM-E编码区DNA片段的3′端的21nt序列与Sindbis 26S DNA片段的5′端的部分基因序列相同。Sindbis 26S DNA片段的3′端22nt序列与C编码区DNA片段的5′端的部分基因序列相同。
e)以C编码区DNA片段、preM-E编码区DNA片段和Sindbis 26S DNA片段为模板，以GCGCTCTAGAATGACTGCAGGCATGATCATTATG(SEQ ID NO27)和GTATAGAGCTCTTATCTGCGTCTCCTGTTCAAGAT(SEQ ID NO28)为引物，用fusing PCR的方法制备preME-26S-C片段。
2.建立登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子。
a)将步骤1中制备的preME-26S-C片段和SindbisRNA复制子cDNA克隆(STRATAGENE公司)用Xba I和Sac I进行消化。用Qiagen spincolumn(QIAGEN Inc.)对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(New England Bio lab)连接，并转化至大肠杆菌内，克隆产生登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子cDNA克隆，并用Qiagen spin column(QIAGEN Inc.)进行纯化。
b)用Xho I内切酶将步骤a)中产生的登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子cDNA克隆线性化；c)用DNA依赖性Sp6 RNA聚合酶(DNA dependent Sp6 RNApolymerase)将线性化的登革热病毒结构蛋白基因重组的SindbisRNA复制子cDNA克隆转录成RNA，即得到登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子。
3.用实施例3中产生的重组HPV登革热病毒RNA复制子转染BHK-21细胞(ATCC#CCL-10)，24小时之后，用上述步骤2的c)中产生的登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子再次转染该细胞。两次转染都是用电击的方法，0.4cm Gene Pulser Cuvette，200 V/950uF。一到两天后，收集培养基上清，可得到每毫升104-105重组HPV登革热病毒RNA复制子假病毒颗粒。
方法三利用Sindbis RNA复制子的假病毒颗粒制备疫苗1.用方法二步骤2的c)中产生的登革热病毒结构蛋白基因重组的SindbisRNA复制子和DH-BB RNA(购自STRATAGENE)同时用电击的方法转染BHK-21细胞(ATCC#CCL-10)，三到五天后，收集培养基上清，可得到登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子的假病毒颗粒。
2.用方法二步骤3中产生的重组HPV登革热病毒RNA复制子假病毒颗粒感染BHK-21细胞(ATCC#CCL-10)。24小时之后，用上述步骤1中产生的登革热病毒结构蛋白基因重组的Sindbis RNA复制子的假病毒颗粒再次感染该细胞。24-48小时后，收集培养基上清，可得到每毫升105-106重组HPV登革热病毒RNA复制子假病毒颗粒。
方法四建立被NS3缺失的登革热病毒cDNA转化的BHK-21包装细胞系1.以pCI(购自PROMEGA，USA)作为模板，以5’CMV和3’CMV作为引物，用PCR的方法制备CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)的DNA片段(简称CMV)，CMV的DNA片段作为早期增强子和启动子，其长度为631bp(SEQ IDNO29)。以实施例1的第1步骤c)制备的pRS/FLD2为模板，以5’DEN5’end和3’DEN5’end作为引物，用PCR的方法制备登革热病毒cDNA的5’端片段(简称DEN5’end)。以上述连个DNA片段作为模板，以5’CMV和3’DEN5’end作为引物，用fusing PCR的方法制备CMV-DEN5’end的DNA片段(简称CMV-DEN5’end)。
2.将步骤1产生的CMV-DEN5’end的DNA片段与pRS424质粒(ATCC#77105)用Kpn I and Apa I进行酶切。用Qiagen spin column(QIAGEN Inc.)对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(购自New England Biolab)连接，并转化至大肠杆菌内。筛选产生CMV-DEN5’end克隆(简称pRS/CMV-DEN5’end)。
3.以实施例1的第1步骤c)制备的pRS/FLD2为模板，以5’DEN3’end and3’DEN3’end作为引物，用PCR的方法制备登革热病毒cDNA的3’端片段(简称DEN3’end)。以5’HDVr和3’HDVr作为引物，用PCR的方法制备肝炎delta病毒抗原血症核酶(hepatitis delta virus antigenomic ribozyme，HDVr)的DNA片段(简称HDVr，SEQ ID NO30)。以pcDNA3(购自INVITROGEN，USA)作为模板，以5’pA和3’pA作为引物，用PCR的方法制备牛生长激素polyA(bovine growth hormone poly A，BGH pA)的DNA片段(简称pA)。以上述三个片段为模板，以5’DEN3’end和3’pA作为引物，用fusing PCR的方法制备DEN3’end-HDVr-pA的DNA片段。
所使用的DNA引物的序列如下
4.将上述步骤2生成的pRS/CMV-DEN5’end与步骤3生成的DEN3’end-HDVr-pA的DNA片段用Apa I and Sac II进行酶切，用Qiagen spin column(QIAGENInc.)对消化产物进行纯化。将上述两个DNA片段用T4连接酶(购自NewEngland Bio lab)连接，并转化至大肠杆菌内。筛选产生pRS/CMV-DEN5’end-DEN3’end-HDVr-pA的克隆。
5.将上述步骤4生成的pRS/CMV-DEN5’end-DEN3’end-HDVr-pA的克隆用Apa1进行酶切，将实施例1的第1步骤c)制备的pRS/FLD2用Xba1 and Sac I进行酶切。将上述酶切产物进行纯化，并将纯化产物转化至酵母菌，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，生成了全长的登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆(简称pRS/CMV/D2)。
6.将步骤5产生的全长的登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆(pRS/CMV/D2)用Xho I进行酶切，得到线性化的全长的登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆。以CAGACTGAAAAAAGTATTGAAGACAATCCAGAGATCGAAGGAATTAAGAACAACCAAATC(SEQ ID NO41)和CTCCACATTTTCCAAGATTTGGTTGTTCTTAATTCC(SEQ ID NO42)为引物，用PCR的方法生成一个75bp长的DNA片段，其序列为CAGACTGAAAAAAGTATTGAAGACAATCCAGAGATCGAAGGAATTAAGAACAACCAAATCTTGGAAAATGTGGAG(SEQ ID NO43)。将上述线性化的全长的登革热病毒RNA复制子的cDNA克隆和75bp长的DNA片段一同转化至酵母菌，利用在酵母菌中相同序列的DNA重组，线性化的全长的登革热病毒RNA复制子的部分NS3编码区基因序列(nt5059-6215)被切除，而得到了NS3缺失的登革热病毒的cDNA克隆。
7.将上述步骤6中产生的NS3缺失的登革热病毒的cDNA克隆DNA和pcDNA3(购自INVITROGEN，USA)同时转染BHK-21 cell(ATCC#CCL-10)。该细胞培养一天后，转换为含有G418(购自SIGMA，USA)的细胞培养液。用实施例3中产生的重组HPV登革热病毒RNA复制子转化抗G418的细胞株，挑选出包装细胞系。该细胞系的产量可以达到106重组HPV登革热病毒RNA复制子假病毒颗粒。
实施例5HPV病毒疫苗的动物实验报告为了证实HPV病毒疫苗的免疫疗效，我们测试了HPV病毒疫苗对C57BL/6小鼠肿瘤模型的影响。
用JHU-1 HPV肿瘤细胞接种C57BL/6小鼠作为肿瘤模型JHU-1 HPV肿瘤细胞含有HPV病毒的E6/E7癌基因。用1×105的JHU-1 HPV肿瘤细胞在500微升的PBS缓冲液，注入到八个星期大的C57BL/6小鼠的脐腹部(FLANK)。JHU-1HPV肿瘤细胞能够100％诱导出实质性的肿瘤。在注入JHU-1 HPV肿瘤细胞七天后，能触摸到肿瘤快。并在十四天后，诱导出来的肿瘤能在6mm以上。
HPV病毒疫苗的治疗方案整个实验分成四组，每组八只C57BL/6小鼠。
PFU＝Infectious Particle of HPV replion-containing VLP在肿瘤对照组和疫苗治疗组里的每只小鼠脐腹部注射1×105JHU-1CELLS，在注入JHU-1细胞后的的十四天，疫苗治疗组和疫苗对照组的小鼠分别皮下注入107的有效疫苗颗粒。并在七天以后，再次皮下注入107PFU的有效疫苗颗粒作为追加治疗。
1.HPV病毒疫苗免疫疗效的观测a.当小鼠接种了JHU-1 HPV肿瘤细胞后，每两天观测和测量肿瘤的生长情况和肿瘤大小。
b.用细胞内染色和流式细胞测定(FLOW CYTOMETRY)的方法对HPV E6/E7-特异性CD8+T-细胞的分析。当疫苗对照组的小鼠在第二次皮下注射HPV-VAC后的第十四天，把脾脏细胞分离出来，然后用荧光标记的IFN-γ和TNF-α抗体染色。染色后的细胞表面的IFN-和TNF用流式细胞仪检测。
2.实验结果
a)HPV病毒疫苗对肿瘤生长的影响肿瘤对照组
*如果小鼠体内的肿瘤大于25毫米以后，该小鼠就不再保留。
疫苗治疗组
我们观察到，在疫苗治疗组，当1×105JHU-1 CELLS注入到C57BL/6小鼠的脐腹部14天后，能够诱导出6mm以上的肿瘤实块。在这个时候，我们给这些小鼠皮下注射107PFU HPV-Vac。在注射的两天后，能够观察到大部份肿瘤开始缩小。七天以后，我们再追加一次疫苗(107PFU HPV-Vac)。在完成两次疫苗注射后一周，50％的小鼠体内的肿瘤基本消失。有两只小鼠的肿瘤有明显缩小，但是有两只小鼠的肿瘤有缓慢增长的趋势。在肿瘤对照组，当1×105JHU-1CELLS注入到C57BL/6小鼠的脐腹部35天后，75％的小鼠体内的肿瘤大于25。
b)HPV病毒疫苗对HPV E6/E7-特异性CD8+T-细胞的的影响
我们用细胞内染色的方法来测定HPV病毒疫苗对HPV E6/E7-特异性CD8+T-细胞的影响，并且观察到HPV病毒疫苗可以激活CD8+T-细胞分泌IFN-γ和TNF-α。
实施例6构建不同的II型登革热病毒疫苗在本实施例中，按实施例1、2和3所述的相同的方法构建了下列II型登革热病毒重组复制子，不同点仅在于C蛋白基因5’序列和NS1蛋白信号肽长度不同。并用实施例4中的方法4制备假病毒颗粒。结果如下
实施例7构建I型登革热病毒疫苗在本实施例中，按实施例1、2和3所述的相同的方法构建了下列登革热病毒重组复制子，不同点仅在于用I型登革热病毒替换实施例1-3中的II型登革热病毒，然后用实施例4中的方法4制备假病毒颗粒。然后，按实施例5中治疗组的相同方案给药，实验动物是实施例5中肿瘤未消失的4只小鼠。
结果，4只中有3只小鼠的肿瘤明显缩小。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海天甲生物医药有限公司美国天甲生物医药有限公司北京东方天甲科技发展有限公司<120>抗人乳头状瘤病毒疫苗<130>040528<150>CN 03115273.2<151>2003-01-30<160>44<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>768<212>DNA<213>人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)<400>1atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact60gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt120ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ctgttgcaag180tgtgactcta cgcttcggct gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tacgttggaa240gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accaatgcac300caaaagagaa ctgcaatgtt tcaggaccca caggagcgac ccagaaagtt accacagtta360tgcacagagc tgcaaacaac tatacatgat ataatattgg aatgtgtgta ctgcaagcaa420cagttactgc gacgtgaggt atatgacttt gcttttcggg atttatgcat agtatataga480gatgggaatc catatgctgt atgtgataaa tgtttaaagt tttattctaa aattagtgag540tatagacatt attgttatag tttgtatgga acaacattag aacagcaata caacaaaccg600ttgtgtgatt tgttaattag gtgtattaac tgtcaaaagc cactgtgtcc tgaagaaaag660caaagacatc tggacaaaaa gcaaagattc cataatataa ggggtcggtg gaccggtcga720tgtatgtctt gttgcagatc atcaagaaca cgtagagaaa cccagctg 768<210>2<211>256<212>PRT<213>人乳头瘤病毒(Human papillomavirus)<400>2Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln1 5 10 15Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser20 25 30Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp35 40 45Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr50 55 60Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu65 70 75 80Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln85 90 95Lys Pro Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu100 105 110Arg Pro Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile115 120 125His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg130 135 140Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg145 150 155 160Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser165 170 175Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr
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<212>DNA<213>巨细胞病毒(cytomegalovirus)<400>29cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 60tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 120gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 180ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 240gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 300cattatgccc agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 360gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg 420tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 480caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg 540ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaacc 595<210>30<211>84<212>DNA<213>肝炎病毒(Hepatitis virus)<400>30gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgca 60cgtccactcg gatggctaag ggag 84<210>31<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>31gcgcgcggta ccttgacatt gattattgac tagtta36<210>32<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>32ggtccacgta gactaacaac tcggttcact aaacgagctc tg 42<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>33agttgttagt ctacgtggac c21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>34ccctgcagca ttccaagtga g21<210>35<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>35ctcacttgga atgctgcagg gcccaaggtg agatgaagct gt 42<210>36<211>42
<212>DNA<213>人工序列<400>36gtggagatgc catgccgacc cagaacctgt tgattcaaca gc 42<210>37<211>48<212>DNA<213>人工序列<400>37gggtcggcat ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccg 48<210>38<211>55<212>DNA<213>人工序列<400>38ctcccttagc catccgagtg gacgtgcgtc ctccttcgga tgcccaggtc ggacc 55<210>39<211>45<212>DNA<213>人工序列<400>39ccactcggat ggctaaggga gaataaaatg aggaaattgc atcgc45<210>40<211>35<212>DNA<213>人工序列<400>40tatatccgcg gatagaatga cacctactca gacaa 35<210>41<211>60<212>DNA<213>人工序列<400>41cagactgaaa aaagtattga agacaatcca gagatcgaag gaattaagaa caaccaaatc60<210>42<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>42ctccacattt tccaagattt ggttgttctt aattcc 36<210>43<211>75<212>DNA<213>人工序列<400>43cagactgaaa aaagtattga agacaatcca gagatcgaag gaattaagaa caaccaaatc60ttggaaaatg tggag 75<210>44<211>5<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(5)<223>信号肽水解酶底物<400>44Pro Gln Ala Gln Ala1 权利要求
1.一种登革热病毒重组复制子，其特征在于，所述的复制子缺失了登革热病毒preM蛋白的全部编码序列，并且包括以下元件a)全部的5’端的非编码区；b)C蛋白前20个氨基酸的编码区；c)NS1蛋白信号肽的编码区；d)所有的非结构蛋白编码区；e)3’端的非编码区；f)位于b)和c)之间的外源核酸序列，所述的外源核酸序列编码HPV抗原、免疫调节因子或HPV抗原与免疫调节因子复合物。
2.如权利要求1所述的复制子，其特征在于，所述的外源核酸序列的3’端具有3’端释放元件，或者NS1蛋白信号肽的编码区前具有5’释放元件，所述的释放元件选自SEQ ID NO4所示的编码口蹄疫病毒自身水解酶的核苷酸序列、编码SEQ ID NO44所示信号肽水解酶底物的核苷酸序列，及其组合。
3.如权利要求1所述的复制子，其特征在于，所述的登革热病毒为登革热病毒I、II、III或IV型。
4.如权利要求1所述的复制子，其特征在于，所述的HPV抗原是HPV的E7-E6片段。
5.一种假病毒颗粒，其特征在于，由权利要求1所述的登革热病毒重组复制子和登革热病毒结构蛋白包装组成。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求5所述的假病毒颗粒和药学上可接受的载体。
7.如权利要求1所述的登革热病毒重组复制子的用途，其特征在于，用于制备治疗和预防以下HPV相关疾病的药物慢性宫颈炎、假性湿疣、疣样病变、尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤样病变、宫颈癌。
8.一种用于包装权利要求1所述的登革热病毒重组复制子的包装细胞，其特征在于，所述的包装细胞选自下组(i)被含有登革热病毒重组复制子缺失的结构蛋白基因的质粒转染的细胞，(ii)被含有登革热病毒重组复制子缺失的结构蛋白基因的辅助病毒载体转染的细胞，和(iii)基因组整合有登革热病毒重组复制子缺失的结构蛋白基因的细胞，且所述的包装细胞能表达包装所述复制子所需的登革热结构蛋白，并且缺失的登革热结构蛋白基因在其中表达时，不影响细胞的生长特性。
9.一种制备假病毒颗粒的方法，其特征在于，包括步骤(i)将权利要求1所述的登革热病毒重组复制子，或者含有所述复制子的假病毒颗粒，导入登革热病毒的包装细胞；(ii)当所述的包装细胞表达登革热病毒结构蛋白时，培养所述的包装细胞，从而产生登革热病毒的假病毒颗粒；或者，当所述的包装细胞不表达登革热病毒结构蛋白时，将辅助病毒复制子导入该包装细胞，其中所述辅助病毒表达登革热病毒的结构蛋白，然后培养所述的包装细胞，从而产生登革热病毒的假病毒颗粒；(iii)回收含有复制子的假病毒颗粒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的包装细胞含有选自下组的登革热病毒结构蛋白表达载体含缺失NS3的登革热基因组序列的表达载体，受四环素调控的基因表达载体。
全文摘要
本发明提供了一种以登革热病毒重组复制子为核心的假病毒颗粒疫苗及其制备方法。所述的疫苗可在被感染的细胞内高效率地表达抗原，由于登革热病毒具有感染树突状细胞的特点，能有效提呈抗原，免疫效果好。此外利用不同型的登革热病毒可以进行有效重复免疫，从而强化机体针对带有这种抗原的病原的免疫。该疫苗可以预防和治疗肿瘤及病毒性疾病。
文档编号C12N15/55GK1524951SQ20041000339
公开日2004年9月1日 申请日期2004年1月30日 优先权日2003年1月30日
发明者庞小伍 申请人:上海天甲生物医药有限公司, 美国天甲生物医药有限公司, 北京东方天甲科技发展有限公司