专利名称：通过pcr检测人乳头瘤状病毒不同基因型的通用引物和方法
技术领域：
本发明涉及用于检测和/或诊断样本中人乳头瘤状病毒(HPV)存在或不存在的PCR引物以及使用所述引物检测和/或分析样本中HPV存在或不存在的方法，更特别地，涉及含有寡核苷酸的PCR引物，该寡核苷酸与不同类型的HPV核酸互补结合并由此获得扩增产物，以及使用所述引物检测和/或分析样本中不同类型HPV存在或不存在的方法。
背景技术：
目前已发现人乳头瘤状病毒(HPV)涉及包括宫颈癌的多种肿瘤类别以及近120种不同的HPV基因型。HPV为环状双链DNA病毒，其基因组大小约为8kb。在感染宿主细胞后，在HPV基因组中E1至E7基因与早期步骤有关，而L1和L2基因与晚期步骤有关。特别地，E6和E7的每种蛋白，其为HPV感染宿主上皮细胞后被表达的致癌蛋白，特异结合宿主细胞的致癌抑制蛋白p53和pRB，并由此消除这些宿主蛋白的致癌抑制功能。因此该HPV的E6和E7蛋白引起所述感染细胞转化并发展为肿瘤形式。
目前，根据E6、E7和L1基因的ORF(开放阅读框架)序列的不同，已经发现超过120种不同的HPV基因型。当其ORF的核苷酸序列差异分别为超过10％、2％至10％、以及低于2％时，其被定义为新基因型、新的亚型和新的变体。特别地，HPV 2、3、6、7、10、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69及70型为已知的引起宫颈癌的原病毒。
据WHO统计，每年世界上有约450,000例新发宫颈癌患者，除乳腺癌之外，其为妇女癌症的第一位。特别是，宫颈癌为最常见的妇女癌症并且其在发展中国家可导致约300,000患者死亡。
HPV感染宫颈上皮基底细胞后，它们发展为诸如低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)和上皮内瘤形成的先兆综合症，并最终发展为侵袭性癌症。因有发展为癌前的先兆阶段，在早期对这些先兆综合症进行诊断并由此预防宫颈癌是可能的。以色列已经建立了对宫颈癌和其前期病症的早期医疗体检，其宫颈癌的发病率为每十万个人中3.8例。另一方面，诸如哥伦比亚的发展中国家宫颈癌的发病率为每十万个人中48.2例。
从二十世纪四十年代起，普遍实行用来筛选原发宫颈癌和其前期病变的基于细胞形态学的细胞涂片试验。然而，诸如Pap涂片试验的细胞学试验并不真实且有高达30％-40％的假阳性。
再者，HPV杂交捕获II型，其通过抗体酶显色来检测宫颈癌涂片DNA与RNA探针间的液体状态互补杂交化合物，已经用于辅助筛选或跟踪宫颈癌及其前期病变。然而，这种试验因其高成本而不能广泛使用。因此，仍然需要开发在早期阶段对宫颈癌和其前期病症进行常规诊断的方法。
因此，为了检测样本中不同类型的HPV，已经开展了利用PCR方法检测早期通常的HPV型的广泛研究，PCR可简单快速地扩增特异核苷酸序列的DNA片段。
PCR(多聚酶链式反应)方法，参见如美国专利第4,683,195和第4,683,202号，在此引用作为本发明的参考，该方法为通过加入与靶序列互补的核酸片段(寡引物)，并利用温度的变化进行变性步骤、退火步骤和聚合步骤的重复步骤来扩增所述靶序列的较小的单元，可对特异有机体的靶核酸序列进行检测的技术。通过使用PCR方法可以容易地检测样本DNA是否被HPV感染。
鉴于实际的临床检验，因其真实并可大规模检测HPV感染，所述的PCR方法比诸如Pap涂片的细胞学试验有优势。另外，在试验成本、处理时间、检测敏感性、检测特异性等等方面，PCR方法优于细胞学试验或液体状态杂交捕获方法。
因此，利用PCR方法检测和/或诊断样本中HPV型具有极大潜力。例如，美国专利第5,484,699号(Bouma Stanley等)，其在此引用作为本发明的参考，公开了用于扩增与宫颈癌特异相关的高风险HPV型的DNA片段的核苷酸及利用该核苷酸检测高风险HPV型的方法。然而，美国专利第5,484,699号公开了产生针对特异HPV型DNA扩增产物的核苷酸，因此其不能检测非高风险HPV型。
此外，美国专利第6,352,825号，其在此引用作为本发明的参考，公开了扩增相当不同的HPV型核酸的引物。但这些引物只能扩增诸如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、54、55、56、57、58的高风险组核酸。因此这种引物不能检测低风险HPV型和其它类型核酸。
目前，在世界范围的临床检验中已使用了用于诊断是否有HPV感染的通用引物。例如，主要在北美洲、南美洲和亚洲使用的MY09/MY11引物组，广泛在欧洲使用的GP5+/GP6+引物组，以及广泛使用的诸如FAP59/FAP64、PGMY09/PGMY11的新开发的其它引物组。
然而，因为与分类超过120种类型的不同HPV型比较这些引物组只能检测有限的HPV型，并对HPV型缺乏敏感性，所以这些世界范围广泛使用的引物组也有缺陷。因此虽然它们有其它的价值和用途，这些通用引物组在临床领域中的使用是有限的。
因此，目前仍需要开发通用引物，不仅用来产生不同致癌HPV型记分的DNA扩增产物并由此检测样本中致癌HPV型，而且通过增强对HPV型的敏感性，在早期阶段筛选宫颈癌和其前期病变。
发明内容
因此，本发明涉及同时检测不同类别HPV型DNA的通用引物，该引物基本上排除了本领域的限制和缺陷所产生的一个或多个问题。
本发明的优点是提供能够与宫颈癌或其前期病变有关的致癌HPV型互补结合的通用引物，并检测样本中所述致癌HPV型的存在与否。
本发明的另一优点是提供利用所述引物检测所述致癌HPV型存在与否的方法。
本发明另外的特征和优点将在以下的说明书中给出，部分可从说明书中显而易见并从本发明的实践中习得。从本发明的公开说明书、其权利要求书以及附图中特别给出的组成部分可实现和达到本发明的上述和其它优点。
为实现根据本发明的上述和其它优点并依照本发明目的，作为具体和广泛的描述，本发明提供用于检测HPV基因型的通用引物，其中所述引物为选自SEQ ID NO1至SEQ ID NO14。
另一方面，本发明提供扩增HPV基因型的核酸扩增步骤中使用的通用引物对，其中第一引物为选自SEQ ID NO1至SEQ ID NO7的寡核苷酸以及第二引物为选自SEQ ID NO8至SEQ ID NO14的寡苷核酸。
另一方面，本发明的用于扩增人乳头瘤状病毒基因型DNA的方法包括利用选自所述通用引物对的至少一对引物来进行核酸的扩增步骤。
另一方面，本发明提供用于分析样本中人乳头瘤状病毒基因型存在分析样本的方法，其包括如下步骤(a)通过使用选自通用引物的至少一对引物进行核酸扩增步骤来扩增所述样本中人乳头瘤状病毒DNA；及(b)检测扩增产物，其中所述扩增产物的出现表明所述样本中存在人乳头瘤状病毒基因型。
此外，在另一方面，本发明提供PCR试剂盒，其包括所述的通用引物对、用于扩增核酸的聚合酶、缓冲液、四种核苷酸。
应理解，上述一般性描述及以下的详细描述为示例性和解释性的，意在提供对权利要求书的进一步的解释。
附图的简要说明
图1A至1C分别显示当使用根据本发明的一个实施方案产生的引物对来扩增HPV-16感染Caski细胞株、HPV-18感染HeLa细胞株及HPV非感染K562细胞株时的PCR结果的凝胶电泳照片；图2A至2H分别显示当使用根据本发明的另一实施方案产生的引物对来扩增HPV-16感染Caski细胞株、HPV-18感染HeLa细胞株及HPV非感染K562细胞株时的PCR结果的凝胶电泳照片；图3A至3C分别显示当使用根据本发明一个实施方案产生的3对引物来扩增挑选的含HPV DNA的质粒时的PCR结果的凝胶电泳照片；图4A至4G分别显示当使用根据本发明另一个实施方案产生的7对引物来扩增挑选的含HPV DNA的质粒时的PCR结果的凝胶电泳照片；
图5显示当使用根据本发明另一个实施方案产生的引物对来扩增挑选的含HPV DNA的质粒时的PCR结果的凝胶电泳照片；图6A至6T分别为当使用根据本发明的一个实施方案产生的3对引物，以及常规用来扩增HPV DNA的引物对，通过常规检测来扩增从宫颈癌相关个体中获得的DNA时的PCR结果的凝胶电泳照片；图7A至7J分别显示当使用根据本发明一个实施方案产生的3对引物，以及常规用来扩增HPV DNA的引物对，通过常规检测来扩增从宫颈癌非相关个体中获得的DNA时的PCR结果的凝胶电泳照片；图8A至8T分别显示当使用根据本发明的另一个实施方案产生的7对引物，通过常规检测来扩增从宫颈癌相关个体中获得的DNA时的PCR结果凝胶电泳照片；及图9A至9J分别显示当使用据本发明另一个实施方案产生的7对引物，通过常规检测来扩增从宫颈癌非相关个体中获得的DNA时的PCR结果凝胶电泳照片。
实施本发明的最佳方式如上所述，常规的通过PCR能够与不同类型的HPV DNA杂交的寡核苷酸通用引物，只能检测存在的HPV类型中相对有限的类型，并缺乏对HPV类型的敏感性。本发明设计的引物对与常规的通用PCR引物对比较能够与更多HPV类型杂交，并由此通过使用本发明的引物对进行核酸扩增步骤来检测更多不同的HPV类型。
首先，根据72种HPV类型的全长核苷酸序列，利用计算机程序，本发明设计具有代表性的通用PCR引物。本发明所设计的PCR引物能够与宫颈癌相关的所有类型的HPV的核酸序列互补结合，其不仅包括高风险组而且包括低风险组并形成所述HPV类型的扩增产物。
根据本发明所设计的引物为具有约30bp的有限序列长度的寡核苷酸，并产生200-400bp的扩增产物。在有限的条件下，本发明人设计14条寡核苷酸序列。在此14条寡核苷酸序列中，7条核苷酸设计成5’引物(正向引物)以及另外7条核苷酸设计成3’引物(反向引物)。
然后，本发明人在所设计的5’引物中挑选至少1条核苷酸以及在所设计的3’引物中挑选至少1条核苷酸来组成引物对，并验证其扩增结果。
本发明所设计的5’引物和3’引物中的任何一条寡核苷酸序列都能够与包括宫颈癌相关HPV类型的不同类型HPV核酸序列互补结合。然而，特别的引物对，包括特异的选自组成所述5’引物的特异寡核苷酸序列以及选自组成所述3’引物的特异寡核苷酸序列，能够扩增更多不同类型的HPV。
通过上述方法，用挑选的11对引物来扩增更多的不同类型的HPV的核酸。通过自动核酸序列仪(ExpediteTM8909合成仪，ABI公司)来合成所挑选的引物。在PCR步骤中使用这些合成的引物来扩增代表性HPV感染细胞株的DNA，并通过电泳来验证所产生的扩增产物。
而且，在PCR中利用合成的11对引物来扩增含有HPV DNA的不同质粒，并根据其设想的扩增实验利用电泳步骤来验证扩增产物。
此外，通过使用合成的11对引物来扩增所述样本并验证扩增产物的存在与否而进行的PCR步骤能够诊断HPV类型是否感染获得自个体宫颈涂片的样本。
为在临床检验中使用合成的引物对，本发明人通过诸如阴道镜的临床病理试验检验个体宫颈涂片获得的样本，并将所述个体分为与宫颈癌相关的异常个体和与宫颈癌无关的正常个体。然后，通过扩增杂交捕获II型(DIGENE Corp.)和DNA芯片试验(BIOMDERAB Co.Ltd.)检测一些异常和正常的个体来更特异地验证HPV感染。
因此，使用本发明的通用引物和已知的代表性通用引物对MY09/MY11来扩增获得自所述异常个体或正常个体的每种DNA样本。本发明人证实了本发明的通用引物对可产生扩增产物，这与细胞学试验、杂交捕获II型和DNA芯片试验的结果一致，并且其能够准确和早期地用于诊断样本是否被HPV感染。也就是本发明所述引物对针对获得自被检验为宫颈癌相关个体的DNA样本产生扩增产物，而针对获得自被检验为宫颈癌无关个体的DNA样本不产生扩增产物。
以下的实施例是为了更详细地说明本发明而进行的示例性说明，但是本发明并不限于以下的实施例。
实施例实施例1PCR引物设计与合成(1)PCR引物设计根据本发明的目的，设计能够与不同类型HPV互补结合并由此扩增全部HPV类型DNA的作为PCR通用引物的核苷酸序列。
首先，从美国NCBI(国家生物技术信息中心)和Los Alamos的国家HPV数据库导出诸如HPV 1a、2a、3、4、5、6b、7、8、9、10、11、12、13、15、16、16r、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35h、36、37、38、39、40、41、42、44、45、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、63、65、66、67、68、70、72、73、74、75、76、77及80型的72种HPV类型的全长核酸序列。
利用Clustal W计算机程序(DNSSTAR，MegAlignTM5，DNASTARInc.)进行导出的DNA序列的DNA序列同源性研究，该程序通过成对对齐、多序列对齐和种系发生树来筛选组中代表性碱基序列。随后利用另一计算机程序(primer premier 6，PREMIER Biosoft International Co.)设计基于筛选的碱基序列的PCR通用引物。所述引物设置成约27±3bp或约31±2bp长度的核酸序列，且其扩增产物约为200-500bp，并设计出30对PCR通用引物对。
(2)实际扩增和PCR引物合成所设计的30对引物的每一对用于扩增实际的72种HPV类型，其是利用另一种计算机程序(Amplify 1.2，Wisconsin大学)的引物设计步骤中被导出。利用所设计的PCR通用引物对来验证扩增不同HPV类型的DNA的寡核苷酸序列，特别是诸如HPV 2a、3、6b、7、10、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、70、73及74型的与宫颈癌相关的36种HPV类型。一些验证的寡核苷酸序列用作5’引物(正向引物)而另一些用作3’引物(反向引物)。
将所挑选的5’引物和3’引物任意组合来进行实际的扩增。随后，确定了扩增不同HPV类型DNA的三对引物。在下文中，为便于本发明的描述，根据实施例1的三对组合引物中的每一对分别称为AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3。表1显示了核苷酸序列、SEQ ID No、扩增HPV类型、扩增产物大小以及所述确定引物对的扩增区域的实际扩增结果。
表1HPV DNA扩增的探针或通用引物
*5’引物(正向引物)；**3’引物(反向引物)
而且，表2显示了通过AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3对代表性宫颈癌相关HPV类型的实际扩增产物大小。
表2.通用引物的预期扩增产物大小
*没有扩增(3)挑选的通用PCR引物的合成合成上述挑选的三对PCR通用引物AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3。通过ExpediteTM8909合成仪(ABI inc.)来合成上述引物对，其中使用基于寡核苷酸亚磷酰胺合成化学的固相合成方法合成。开始时，在固定了位于寡核苷酸3’端的核苷酸的CPG柱上进行合成反应。通过重复基本的脱三苯甲基反应、耦合反应、加帽反应和氧化反应来使核苷酸聚合形成挑选的PCR引物的寡核苷酸。在终止合成后，在CGP柱中加入30％的氨水溶液来去除寡聚物，并随后使用速度真空(Speed Vacuum)在55℃将所述的寡聚物干燥浓缩12小时使其脱保护。利用反向液相色谱和阴离子交换色谱来纯化该浓缩的寡聚物。通过检测在260nm波长的吸光度来定量分析该纯化的最终寡聚物。
实施例2PCR引物设计与合成除将所设计的通用PCR引物设置为约24±3bp和约33±2bp的核苷酸序列且其扩增产物约为170～550bp外，以与实施例1相同的条件与步骤完成实施例2。
在上述条件下，挑选最终的8对通用引物。在下文中为便于表述，根据本发明实施例所述的8对组合引物的每一对分别称为AlbioGP3、AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP11。表3显示了核酸序列、SEQ ID No、扩增HPV类型、扩增产物大小以及所述确定引物对的扩增区域的实际扩增结果。而且表4显示了通过利用AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP11对代表性宫颈癌相关HPV类型的实际扩增产物大小。
以与实施例1的相同条件和步骤合成挑选的8对通用引物对(AlbioGP4至AlbioGP11)。
表3用于HPV DNA扩增的探针与通用引物
*与AlbioGP1基本相同；**与AlbioGP2基本相同；***5’引物(正向引物)；****3’引物(反向引物)；
表4.通用引物预期的扩增产物大小
实施例3利用通用引物的PCR扩增利用实施例1合成的3对引物(AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3)通过PCR来扩增作为靶标的HPV 16感染Caski细胞株(ATCC CRL-1550)、HPV 18感染HeLa细胞株(ATCC CCL-2)及非HPV感染K-562细胞株(KCLB-10243，韩国细胞株库)。
根据制备者说明书来培养每一种Caski、HeLa及K-562细胞并随后向Caski和HeLa细胞中加入0.25％胰蛋白酶溶液，离心来自培养瓶中的培养细胞株。用Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(Gibco Inc.)洗涤每一种培养的Caski、HeLa及K-562细胞株一次，在显微镜下检测细胞数量。随后将来自培养细胞株的2×104个细胞悬浮在230μL(微升)的D.W中，在100℃(摄氏)下加热15分钟来提取细胞DNA。在室温下冷却提取的细胞DNA并在12,000rpm下离心5分钟。从所述离心中获得的上清液用作模板DNA溶液。
利用所述的DNA溶液和PCR反应溶液(TaKaRa Co.，LTD.，日本)完成PCR反应。PCR溶液由2.5μL的10×缓冲液，3.75μL的10mM MgCl2，0.5μL的10mM dNTPs，0.5μL(5单位)的Taq聚合酶，1μL(50pM)实施例1合成的每一对通用引物对及11.5μL每一种DNA模板构成。该PCR溶液在94℃预热5分钟后，在94℃变性1分钟，42℃退火1分钟，及72℃延伸1分钟下进行49个循环，并最终72℃加热5分钟来进行扩增。对于HPV检测，将5μL每一种最终扩增反应产物与DNA分子大小标准标志转移到用0.00005％溴化乙啶溶液标记的2％琼脂糖凝胶上，用于电泳。通过将显示在凝胶中每一泳道的条带大小与实施例1的表1所列期望扩增大小比较，能够确认正确的条带。
图1A至1C分别为当使用实施例1合成的AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3扩增每一种HPV 16感染Caski细胞株、HPV 18感染HeLa细胞株及非HPV感染K-562细胞株时，显示PCR结果的溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳照片。在图中，M带为标准大小标志，其旁边的数字表示标志的大小，在底部的泳道1、泳道2及泳道3分别为利用AlbioGP1、AlbioGP2及AlbioGP3引物的扩增。
如图所示，每一AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3对于HPV 16感染Caski细胞株(图1A)、HPV 18感染HeLa细胞株(图1B)产生的扩增产物与表2期望结果相同，但对于非HPV感染K-562细胞株(图1C)不产生扩增产物。
实施例4利用通用引物对的PCR扩增利用实施例2合成的8对引物(AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP3)通过PCR来扩增作为靶标的HPV 16感染Caski细胞株(ATCC CRL-1550)、HPV 18感染HeLa细胞株(ATCC CCL-2)及非HPV感染K-562细胞株(KCLB-10243，韩国细胞株库)。
利用Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(Gibco Inc.)洗涤根据制备者说明书来培养的每一种Caski、HeLa及K-562细胞一次，在显微镜下检测细胞数量。随后分离来自培养细胞株的2×106个细胞并利用“基因组分离试剂盒(Cat.No.K-3032，Bioneer Inc.)”进行纯化，并溶于200μL(微升)D.W中获得最终的模板DNA溶液。
除在总的25μL PCR反应溶液中含有8.0μL的每种模板DNA外，以与实施例3相同的条件和步骤进行PCR反应。
图2A至2H分别为当使用实施例1合成的AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10和AlbioGP11扩增每一种HPV 16感染Caski细胞株、HPV 18感染HeLa细胞株及非HPV感染K-562细胞株时，显示PCR结果的溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳照片。在图中，M带为标准大小标志，其旁边的数据显示扩增产物的大小，而且在底部的泳道1、泳道2及泳道3分别为靶细胞株CaSki、HeLa和K562的结果。
图2A至2H显示的条带与表4中对于靶标HPV 16感染Caski细胞株(泳道1)、HPV 18感染HeLa细胞株(泳道2)的预期结果相同，即图2A中AlbioGP4为398bp；图2B中AlbioGP5为320bp；图2C中AlbioGP6为530bp；图2D中AlbioGP7为210bp；图2E中AlbioGP8为430bp；图2F中AlbioGP9为298bp；图2G AlbioGP10为300bp；以及图2H中AlbioGP11为172bp。但是，对于非HPV感染K562细胞株(泳道3)每一对通用引物不产生扩增产物。
实施例5利用含HPV不同质粒的PCR扩增在此实施例中，利用实施例1合成的引物对AlbioGP1、AlbioGP2及AlbioGP3来扩增作为靶标的含有不同HPV类型的质粒DNA的大肠杆菌菌株。这些菌株为ATCC 45021(HPV 1a)、ATCC(HPV 2a)、ATCC 45150(HPV 6b)、ATCC 45151(HPV 11)、ATCC 45113(HPV 16)、ATCC 45152(HPV 18)、ATCC 65446(HPV 31)及ATCC 40338(ATCC 43)。
每种大肠杆菌菌株含有每种HPV类型的DNA插入质粒，将该菌株摇动培养在37 LB液体培养基中，并利用“Qiafilter Plasmid Maxi试剂盒(Cat.No.12263，QIAGEN Corp.)”来分离和纯化，调节浓度到10pg/μL。该调节浓度的菌株作为模板DNA溶液使用。
利用每一种通用引物对，以与实施例3相同的反应组合和步骤完成每一种模板DNA的PCR扩增反应。将显示在凝胶中每一泳道的条带大小与实施例1中表2的期望扩增大小比较，确定正确的条带。
图3A至3C分别为当使用实施例1合成的AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3扩增含有特异HPV类型的质粒DNA的大肠杆菌菌株时，显示PCR结果的凝胶电泳照片。在图中，M带为标准大小标志，其旁边的数据显示扩增产物的大小，而在底部的数据显示插入所述菌株的HPV类型。
图3A至3C显示的条带与表2对于含特异HPV DNA的大肠杆菌的预测结果相同，即，对每一目标菌株AlbioGP1约为300～320bp(图3A)；对每一目标菌株AlbioGP2约为300～320bp(图3B)；及对每一目标菌株AlbioGP3约为200～220bp，含有HPV 1a质粒DNA菌株(图3C)除外。
实施例6利用含HPV的不同质粒的PCR扩增在此实施例中，利用实施例2合成的AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP10的7对通用引物对来扩增作为靶标的含有不同HPV类型的质粒DNA的大肠杆菌菌株。除不使用含有HPV 1a DNA的ATCC 45021菌株外，靶标菌株与实施例5相同。
每种大肠杆菌菌株含有每种HPV类型的DNA插入质粒，将该菌株摇动培养在37LB液体培养基中，并利用“Qiafilter Plasmid Maxi试剂盒(Cat.No.12263，QIAGEN Corp.)”来分离和纯化，调节浓度到100ng/μL。这些调节了浓度的菌株作为模板DNA溶液使用。
利用每一种通用引物对，以与实施例4相同的反应组合和步骤完成每一种模板DNA的PCR扩增反应。将显示在凝胶中每一泳道的条带大小与实施例2中表4的期望扩增大小比较，确定正确的条带。
图4A至4G分别为当使用实施例2合成的AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9及AlbioGP10扩增含有16型(ATCC 45113菌株)、18型(ATCC 45142菌株)、31型(ATCC 65446菌株)、43型(ATCC 40338菌株)、2a型(ATCC45202菌株)、6b型(ATCC 45140菌株)及11型(ATCC 45152菌株)的HPVDNA的每种大肠杆菌菌株时，显示PCR结果的凝胶电泳照片。在图中，M带为标准大小标志，其旁边的数据显示标志大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6及泳道7分别显示利用通用引物对AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9及AlbioGP10的结果。
图4A至4G显示的条带与表4对于含特异HPV DNA的大肠杆菌的预测结果相同，即，在图4A至4G每一图中的泳道1，对每一目标菌株AlbioGP4约为380～410bp；在图4A至4G每一图中的泳道2，对每一目标菌株AlbioGP5约为310～330bp；在图4A至4G每一图中的泳道3，对每一目标菌株AlbioGP6约为520～550bp；在图4A至4G每一图中的泳道4，对每一目标菌株AlbioGP7约为210～230bp；在图4A至4G每一图中的泳道5，对每一目标菌株AlbioGP8约为430～450bp；在图4A至4G每一图中的泳道6，对每一目标菌株AlbioGP9约为280～310bp；及在图4A至4G每一图中的泳道7，对每一目标菌株AlbioGP10约为290～310bp。
实施例7利用含HPV的不同质粒的PCR扩增在此实施例中，利用实施例2合成的通用引物对AlbioGP11来扩增作为靶标的含有不同HPV类型的质粒DNA的大肠杆菌菌株。靶标菌株与实施例6相同。
提取含有每种HPV类型的质粒DNA的每种大肠杆菌作为模板DNA溶液，并以与实施例6相同的反应条件和步骤完成PCR扩增反应。
图5为当使用AlbioGP11扩增含有特异HPV类型的每一种大肠杆菌菌株时，显示PCR结果的凝胶电泳照片。在图中，M带为标准大小标志，其旁边的数据显示标志大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6及泳道7分别显示含有16型(ATCC 45113菌株)、18型(ATCC 45142菌株)、31型(ATCC 65446菌株)、43型(ATCC 40338菌株)、2a型(ATCC 45202菌株)、6b型(ATCC 45140菌株)及11型(ATCC45152菌株)的HPV DNA的靶标大肠杆菌菌株的结果。
图5显示条带与表4对于含有特异HPV DNA的每种大肠杆菌的期望结果相同，也就是，对于每种含有HPV 16 DNA的ATCC 45113菌株、含有HPV 18 DNA的ATCC 45142菌株、含有HPV 31 DNA的ATCC65446菌株、含有HPV 43 DNA的ATCC 40338菌株、含有HPV 2a DNA的ATCC 45202菌株、含有HPV 6b的ATCC 45140菌株及含有HPV 11DNA的ATCC 45151菌株，AlbioGP11产生约160～180bp的扩增产物。
对比实施例1HPV感染的细胞学检验在此对比实施例中，根据常规的细胞学试验对获得自个体的临床样本进行试验。
在主管临床医生的控制下，对获得自随机挑选的30例个体的临床样本进行诸如阴道镜试验、宫颈成像试验(cervicography test)、活检试验及Pap涂片的细胞学试验，所述个体在“Pochon CHA大学医学院”医院的附属妇科癌症中心看过门诊。如表4所示，其显示了细胞学试验的结果，个体1、2、3、4、5、6、7、9、10、12、13、14、18、19和20被诊断为SCC(鳞状细胞癌)；个体6被诊断为“CIS(原位癌)”，其为宫颈癌的前期病变；以及个体8、11、15、16和17被诊断为“SIL(鳞状上皮内病变)”，其也为宫颈癌的早期病变。这些20例个体被分类为异常患者。
其它个体中，由于个体21、22、23、26和27具有正常的宫颈细胞、个体24、28、29和30仅具有与宫颈癌无关的肌瘤、以及个体25仅具有与宫颈癌无关的子宫内膜异位症，因此被归类为宫颈癌非相关患者。
表5.细胞学试验的临床结果
*鳞状细胞癌；**原位癌；***鳞状上皮内病变****子宫肌瘤对比实施例2杂交捕获试验与DNA芯片试验在此对比实施例中，基于杂交捕获(hybrid capture)II型试验和DNA芯片试验，对获得自对比实施例1中个体的样本进行检测来诊断HPV感染与否。表6显示依照杂交捕获II型和DNA芯片试验的试验结果。
利用杂交捕获II型试验(DIGENE Corp.)对来自个体1、6、8、9、21、22、23、24、25和28的样本进行试验。根据杂交捕获II型试验，个体1、6、8和9被诊断为宫颈癌阳性以及个体21、22、23、24、25和28被诊断为宫颈癌阴性。
利用DNA芯片试验(BIOMEDRAB Co.，LTD，韩国)对来自个体2、3、4、5、10、11、12、18、19和20的样本进行试验。个体2、3、4、5、10、11、12、18、19和20的样本分别被诊断为被HPV 16、16、16、16、16、58、16、16、58和58型感染。这些的杂交捕获试验与DNA芯片试验的结果与对比实施例1的结果是相同的。
表6.杂交捕获和DNA芯片的临床结果
*未进行试验实施例8通过通用引物对进行宫颈癌的诊断在此实施例中，利用实施例1中AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3的通用引物对和在PCR中通常用于HPV的检测的通用引物组合MY09(5’-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’，SEQ ID No15)/MY11(5’-GC MCAGGGWCATAAYAATGG-3’，SEQ ID No16)，对作为靶DNA的来自对比实施例1中的异常个体的样本进行扩增并随后进行电泳。以常规步骤获得异常个体的DNA样本，并且根据实施例3所述的相同条件和步骤进行PCR和电泳。
图6A至6T分别为当利用实施例1合成的3对引物及常规用于扩增HPV DNA的引物对来扩增来自对比实施例1的异常个体(个体1至20)宫颈癌相关DNA样本时，显示PCR结果的凝胶电泳照片。
在图中，M带为标准大小标志，其旁边的数据显示标志大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4分别显示利用引物对AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3及MY09/MY11组合的结果。
图6A至6G显示的条带与表4对于来自宫颈癌相关个体的每一种DNA样本的预测结果相同，即，在图6A至6T中的每一图的泳道1中AlbioGP1约为310～320bp；在图6A至6T中的每一图的泳道2中AlbioGP2约为300～320bp；及在图6A至6T中的每一图的泳道3中AlbioGP3约为210～230bp。特别是，利用引物对AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3而非MY09/MY11组合的来扩增作为靶标的来自宫颈癌复发患者的DNA样本(对比实施例1的个体14)的结果如图6N所示。
实施例9通过通用引物对进行宫颈癌的诊断在此实施例中，利用与实施例8相同的条件和步骤来扩增作为靶标DNA的来自对比实施例1的正常个体的样本。
图7A至7J分别为当利用AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3以及通常使用的引物对MY09/NY11引物组合来扩增每个来自对比实施例1正常个体(个体21至30)的宫颈癌非相关的DNA样本时，显示的PCR结果的凝胶电泳照片。
在图中，M带为标准大小标志，边上的数据显示标志的大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4分别显示利用引物对AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3及MY09/MY11组合的结果。
如图6A至6G所示，在使用每一种本发明的AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3及MY09/MY11引物组合情况下，没有扩增出来自正常个体的DNA样本。
对比实施例3对HPV感染的细胞学检验在此对比实施例中，根据与对比实施例1步骤相同的常规细胞学试验检验来自30例个体的临床样本。
表7所示为30例个体的细胞学试验结果。如表7所示，个体1、2、5、7、8、13、14、16、17及18被诊断为HSIL(高度鳞状上皮内病变)，个体6、9、11、12、19和20被诊断为“ASCUS(非典型鳞状细胞但意义未明确)，二者均被视为宫颈癌的前期病变，以及个体3、4、10及15被诊断为“SCC(鳞状细胞癌)。此20例个体归类为异常患者。另一方面，其它个体归类为非宫颈癌相关的正常患者。
表7.细胞学试验临床结果
*高度鳞状上皮内癌；**鳞状细胞病变；及***非典型鳞状细胞但意义未明确对比实施例4杂交捕获试验与DNA芯片试验在此对比实施例中，根据杂交捕获II型试验进行检测来自对比实施例1的个体DNA样本来诊断HPV的感染与否。
利用杂交捕获II型方法(DIGENE Corp.)检测来自个体1至30的样本。来自宫颈癌相关异常个体1～11和11～19的每一样本被诊断为宫颈癌阳性，而非宫颈癌相关的正常个体的每一样本被诊断为宫颈癌阴性。这些杂交捕获II型为基础的试验结果与对比实施例1的结果相同。然而，来自对比实施例3的异常个体12和20的样本被诊断为宫颈癌阴性。
表8.杂交捕获II型临床结果
实施例10利用通用引物对对宫颈瘤形成的诊断在此实施例中，利用实施例2中的通用引物对AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP9及AlbioGP10在PCR中对来自对比实施例3的异常个体DNA样本进行扩增并随后进行电泳来早期诊断HPV感染和宫颈瘤形成。以常规步骤获得异常个体的DNA样本并以与实施例4相同的条件和步骤进行PCR和电泳。
图8A至8T分别为当利用根据实施例2合成的7对引物来扩增来自对比实施例3的异常个体(个体1至20)的宫颈癌相关DNA样本时，显示PCR结果的凝胶电泳照片。
在图中，M条带为标准大小标志，边上的数据显示标志的大小，底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6和泳道7分别显示利用引物对AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9和AlbioGP10的结果。
图8A至8T显示的条带与表4对每一种来自宫颈瘤形成相关个体的DNA样本的预测结果相同，即，在图8A至8T的每一图的泳道1中AlbioGP4约为310～320bp；在图8A至8T的每一图的泳道2中AlbioGP5约为300～320bp；在图8A至8T的每一图的泳道3中AlbioGP6约为210～230bp；在图8A至8T的每一图的泳道4中AlbioGP7约为～430bp；在图8A至8T的每一图的泳道5中AlbioGP8约为～444bp；在图8A至8T的每一图的泳道6中AlbioGP9约为～450bp；及在图8A至8T的每一图的泳道7中AlbioGP10约为～33bp。
实施例11通用引物对对正常临床样本的诊断在此实施例中，以与实施例8相同的条件和步骤扩增作为靶标DNA的来自对比实施例3的正常个体样本。
图9A至9J分别为，当利用AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP9及AlbioGP10对来自对比实施例3的正常个体(个体21至30)非宫颈癌相关的DNA样本进行扩增时，显示PCR结果的凝胶电泳照片。
在图中，M条带为标准大小标志，边上的数据显示标志的大小，底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6和泳道7分别显示利用引物对AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9和AlbioGP10的结果。
如图9A至9G所示，来自正常个体的DNA样本在使用任何AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9及AlbioGP10的情况下均未得到扩增。
在完成和应用本发明时，在不偏离本发明的精神和范围下，可对其进行多种修改和变化，这对于本领域所属技术人员是显而易见的。因此，只要这些修改和变化在所附权利要求和其等价物的范围内，本发明就涵盖了对于本发明的修改和变化。
实用性本发明的寡核苷酸可用作互补结合并扩增通常的不同HPV基因型的引物对。
再者，因其与不同HPV基因组的特异序列互补结合，所以所述的寡核苷酸可用作检测不同HPV基因型的探针。
特别是，在诸如PCR的核酸扩增步骤中，利用所述寡核苷酸作为引物对，以样本DNA作为靶标DNA，并检测扩增产物，能够确定样本DNA是否被HPV感染。
因此，早期诊断和预测宫颈癌及其前期病变也是是可能的。
序列表<110>阿尔生物医药株式会社(ALBIOMED Co.，LTD.)<120>通过PCR检测人乳头瘤状病毒不同基因型的通用引物和方法<150>KR10-2002-0075370<151>2002-11-29<150>KR10-2003-0053147<151>2003-07-31<160>16<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPVDNA的探针<400>1ggcgatatgg ttgatacagg ctttg 25<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>2gcacaactat ttaataagcc atattgg 27<210>3<211>35<212>DNA
<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>3ttcttcttac gaagggaaca actgtttgtt agaca35<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>4gatggtgata tggtagatac aggatttgg 29<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>5tgatatggtt catacaggat ttgg24<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>6tgtacctgct attggggaac actgggctaa ggg 33<210>7<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>7gaggtgggcc ggggncarcc nyt 23<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>8gcgtcagagg ttaccataga gccactagg 29<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>9agaagtaacc atagagccac tagg24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>10aataaactgt aaatcatatt cctc24
<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>11cataattgaa acataaactg taaatcatat tcctc35<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>12taattgggaa tcagaagtaa ccatagagcc act 33<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>13aagccggtgt cgaccatrtc nccrtcyt28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>检测HPV DNA的探针<400>14ccgaagccgg tgtcgaycat rtcnccrt28
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HPV DNA扩增的引物MY09<400>15cgtccmarrg gawactgatc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HPV DNA扩增的引物MY11<400>16gcmcagggwc ataayaatgg 20
权利要求
1.用于扩增和测定人乳头瘤状病毒基因型的通用引物，所述通用引物为选自以下的寡核苷酸(a)SEQ ID NO1或与SEQ ID NO1完全互补的序列；(b)SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2完全互补的序列；(c)SEQ ID NO3或与SEQ ID NO3完全互补的序列；(d)SEQ ID NO4或与SEQ ID NO4完全互补的序列；(e)SEQ ID NO5或与SEQ ID NO5完全互补的序列；(f)SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6完全互补的序列；及(g)SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7完全互补的序列。
2.用于扩增和测定人乳头瘤状病毒基因型的通用引物，所述通用引物为选自以下的寡核苷酸(a)SEQ ID NO8或与SEQ ID NO8完全互补的序列；(b)SEQ ID NO9或与SEQ ID NO9完全互补的序列；(c)SEQ ID NO10或与SEQ ID NO1完全互补的序列；(d)SEQ ID NO11或与SEQ ID NO11完全互补的序列；(e)SEQ ID NO12或与SEQ ID NO12完全互补的序列；(f)SEQ ID NO13或与SEQ ID NO13完全互补的序列；及(g)SEQ ID NO14或与SEQ ID NO14完全互补的序列。
3.扩增人乳头瘤状病毒基因型的核酸扩增步骤中使用的通用引物对，其中第一引物为选自以下的寡核苷酸(a)SEQ ID NO1或与SEQ ID NO1完全互补的序列；(b)SEQ ID NO2或与SEQ ID NO2完全互补的序列；(c)SEQ ID NO3或与SEQ ID NO3完全互补的序列；(d)SEQ ID NO4或与SEQ ID NO4完全互补的序列；(e)SEQ ID NO5或与SEQ ID NO5完全互补的序列；(f)SEQ ID NO6或与SEQ ID NO6完全互补的序列；及(g)SEQ ID NO7或与SEQ ID NO7完全互补的序列；以及第二引物为选自以下的寡核苷酸(h)SEQ ID NO8或与SEQ ID NO8完全互补的序列；(i)SEQ ID NO9或与SEQ ID NO9完全互补的序列；(j)SEQ ID NO10或与SEQ ID NO1完全互补的序列；(k)SEQ ID NO11或与SEQ ID NO11完全互补的序列；(l)SEQ ID NO12或与SEQ ID NO12完全互补的序列；(m)SEQ ID NO13或与SEQ ID NO13完全互补的序列；及(n)SEQ ID NO14或与SEQ ID NO14完全互补的序列。
4.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(a)及第二引物为(h)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型1a、2a、3、4、6b、7、10、11、13、16、16r、18、26、27、28、30、31、32、33、34、36、35h、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、65、66、67、68、70、72、73、74及77型。
5.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(b)及第二引物为(i)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型1a、2a、3、4、6b、7、10、11、13、16、16r、18、26、27、28、30、31、32、33、34、35、35h、39、40、42、43、44、45、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、65、66、67、68、70、72、73、74及77型。
6.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(c)及第二引物为(j)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型2a、3、6b、7、10、11、13、16、16r、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、35h、39、40、42、43、44、45、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、66、67、68、70、72、73、74、75及76型。
7.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(d)及第二引物为(k)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、62、64、66、68、70、73、74、75、76及77型。
8.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(e)及第二引物为(j)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型2a、3、6b、10、11、13、16、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、48、49、50、51、52、54、55、56、57、58、59、61、62、64、66、67、68、70、72、73、75、76及77型。
9.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(f)及第二引物为(1)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型2a、7、10、11、13、16、18、28、29、30、31、32、33、35、39、40、42、43、44、45、52、53、54、55、56、58、59、61、63、66、67、68、70、72、75、75及77型。
10.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(g)及第二引物为(m)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型2a、3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、65、66、67、68、70、73、74及77型。
11.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(g)及第二引物为(n)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型2a、3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、65、66、67、68、70、73、74及77型。
12.如权利要求3所述的通用引物对，其中所述第一引物为(d)及第二引物为(h)，所述的引物对扩增人乳头瘤状病毒基因型3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、65、66、67、68、70、73及74型。
13.扩增人乳头瘤状病毒基因型DNA的方法，其包括利用权利要求3所述的一对通用引物进行核酸扩增的步骤。
14.分析样本中人乳头瘤状病毒基因型存在的方法，其包括步骤(a)利用权利要求3所述的一对通用引物，通过核酸扩增步骤来扩增所述样本中人乳头瘤状病毒DNA；及(b)检测扩增产物，其中所述扩增产物的出现表明所述样本中存在人乳头瘤状病毒基因型。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述扩增产物为标记的。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述样本获得自宫颈细胞。
17.试剂盒，其包括(a)如权利要求3所述的一对引物；(b)dNTP(dATP、dGTP、dCTP及dTTP)的混合物；(c)聚合酶；及(d)PCR缓冲液。
全文摘要
本发明涉及利用引物的聚合酶链式反应的循环来测定样本中不同人乳头瘤状病毒基因型的存在。在该方法中使用的引物为能够与所有宫颈癌及其前期病变相关的HPV基因型特异核酸序列互补结合的通用引物，且该引物能够用于扩增包括致癌高风险组和低风险组的宫颈瘤形成相关的HPV基因型。
文档编号C12Q1/68GK1717498SQ200380104588
公开日2006年1月4日 申请日期2003年11月28日 优先权日2002年11月29日
发明者李相和, 金渊洙, 柳康烈, 金丞兆, 车光烈, 高正在 申请人:Cha威尔因斯株式会社