一种h7n9假病毒的制备方法及该h7n9假病毒的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种H7N9假病毒的制备方法及该H7N9 假病毒的应用。
【背景技术】
[0002] 流感一直是人类健康的主要威胁之一。1918年的西班牙流感，2009年HlNl流 感疫情，和禽流感A/H5N1带来了很大的灾害或损失人类。自2013以来，在中国东部地区 暴发的A/H7N9禽流感疫情已造成超过45人死亡。其风险和流行潜力吸引了全世界的关 注。H7N9禽流感虽然属于低致病性禽流感病毒，但鉴于其感染后的高死亡率，目前，与H7N9 禽流感病毒相关的研究工作仍需在三级生物安全实验室开展，这在很大程度上限制了 H7N9 禽流感相关研究的发展。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计一种H7N9假病毒的制备方法 及该H7N9假病毒的应用的技术方案。
[0004] 所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-Ι载体的多克隆位点之间得到的重 组载体PVAX-HA ; 2) 重组载体pVAX-HA和pNL-4. 3. luc. E-R-质粒按质量比I :3比例共转染293T细胞， 5 h后更换Opti-DMEM培养液，并添加0.5 yg的外源性细菌神经氨酸酶，48 h后收集上 清，即得。
[0005] 所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-Ι载体的多克隆位点之间得到的重 组载体PVAX-HA ; 2) 将H7N9禽流感病毒的NA基因序列插入到pVAX-Ι载体的多克隆位点之间得到的重 组载体PVAX-NA ; 3) 重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-NA和pNL-4. 3. luc. E-R-质粒按质量比I :1 :3比 例共转染293T细胞，5 h后更换Opti-DMEM培养液，48 h后收集上清，即得。
[0006] 所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1)将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-Ι载体的多克隆位点之间得到的重 组载体PVAX-HA ; 2 )将TMPRSS2基因序列插入到pVAX-Ι载体的多克隆位点之间得到的重组载体 PVAX-TMPRSS2； 3)重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-TMPRSS2和pNL-4. 3. luc. E-R-质粒按质量比1 : 0. 012 :3比例共转染293T细胞，5 h后更换含10% FBS的DMEM培养液，并添加0. 5 μ g的 外源性细菌神经氨酸酶，48 h后收集上清，即得。
[0007] 所述的一种H7N9假病毒的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将H7N9禽流感病毒的HA基因序列插入到pVAX-Ι载体的多克隆位点之间得到的重 组载体PVAX-HA ; 2) 将H7N9禽流感病毒的NA基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重 组载体PVAX-NA ; 3 )将TMPRSS2基因序列插入到pVAX-1载体的多克隆位点之间得到的重组载体 PVAX-TMPRSS2； 4) pNL-4. 3. luc. E-R-质粒、重组载体pVAX-HA、重组载体pVAX-NA和重组载体 PVAX-TMPRSS2按质量比1 :1 :0. 012 :3比例共转染293T细胞，5 h后更换含10% FBS的DMEM 培养液，48h后收集上清，即得。
[0008] 所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在进行H7N9流感病毒中和抗 体中的应用。
[0009] 所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在筛选抑制H7N9禽流感病毒 进入细胞抑制剂中的应用。
[0010] 所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在制备预防和治疗流感病毒感 染的免疫制剂中的应用。
[0011] 所述的H7N9假病毒的制备方法制得的H7N9假病毒在假病毒细胞模型在筛选神经 氨酸酶抑制剂中的应用。
[0012] 所述的一种假病毒细胞模型，其特征在于将权利要求1、2、3或4制得的假病毒感 染狗肾细胞MDCK。
[0013] 所述的一种假病毒细胞模型在筛选抑制H7N9禽流感病毒进入细胞抑制剂中的应 用。
[0014] 本发明的有益效果： 1) 本发明为高通量筛选H7N9禽流感病毒进入抑制剂，神经氨酸酶抑制剂提供了一种 简单高效的方法； 2) 本发明为筛选、评价H7N9禽流感病毒中和抗体提供了一种快速高效的方法；采用该 方法筛选相关抗流感药物可在二级生物安全实验室进行，无需三级生物安全实验室； 3) 采用该方法筛选相关抗流感药物，评价抗体中和效价均可在普通二级生物安全实验 室进行，无需三级生物安全实验室； 4) 本发明提供了一种潜在的预防和治疗H7N9禽流感病毒感染的免疫制剂。
【附图说明】
[0015] 图1为H7N9禽流感病毒的HA和NA基因片段电泳图，图中：泳道I :DNA marker DL2000,泳道 2:H7N9/A/Anhui/1/2013 HA 基因片段，泳道 3:H7N9/A/Anhui/1/2013 NA 基 因片段。
[0016] 图2为重组载体pVAX-HA验证图，图中：泳道I :DNA marker DL10000,泳道2 : pVAX-Ι 空载体，泳道3:HA，泳道4:pVAX-HA,泳道5:Bam HI 和 Hind III 双酶切pVAX-HA。
[0017] 图3为重组载体pVAX-NA验证图，图中：泳道I :DNA marker DL10000,泳道2 : pVAX-Ι 空载体，泳道 3:NA，泳道 4:pVAX-NA，泳道 5:Bam HI 和 Hind III 双酶切 pVAX-NA。
[0018] 图4为重组载体pVAX-TMPRSS2验证图，图中：泳道I :DNA marker DL10000,泳道 2 :pVAX-TMPRSS2〇
[0019] 图5为H7N9假病毒Iuc基因的RT-PCR验证图，图中：泳道I :DNA marker DL2000， 泳道2 :H7N9假病毒Iuc基因。
[0020] 图6为westernblot验证H7N9假病毒HA的表达图。
[0021] 图7为westernblot验证H7N9假病毒p24的表达图。
[0022] 图8为不同包装方案包装所得假病毒感染MDCK的效果图。
[0023] 图9为H7N9禽流感病毒中和抗体对H7N9禽流感假病毒及VSVG假病毒感染抑制 效果图。
【具体实施方式】
[0024] 实施例 I :pVAX-HA，pVAX-NA 载体构建 1、 从 GISAID 获取 H7N9/A/Anhui/1/2013(EPI_ISL_138739)株的 HA(439507)， NA (439509)基因的核苷酸序列； 2、 按照哺乳动物细胞密码子优化原则对HA，NA基因序列进行优化，并在序列的5'和3' 分别添加 Hind III和Bam HI限制性内切酶酶切位点，经过优化的序列由金斯瑞合成；其中 H7N9血凝素蛋白基因（HA)哺乳动物表达密码子优化后序列如SEQ ID NO. 1所示，H7N9神 经氨酸酶基因（NA)哺乳动物表达密码子优化后序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0025] 3、Bam HI和Hind III双酶切pVAX-Ι载体，回收载体片段； 4、 将HA，NA片段分别与线性化载体按1:5摩尔比混合，用T4连接酶16°C连接12 h 5、 转化DH5 α感受态，并涂布含卡那霉素的平板； 6、 挑取单菌落进行PCR及测序验证； 7、 挑取阳性菌落接种至200 mL液体LB培养液中，37°C，250 rpm，震荡培养12 h; 8、 用去内毒素质粒提取试剂盒提取质粒pVAX-HA和pVAX-NA，载体鉴定如图（1 )，图 (2)，图（3)所示。
[0026] 实施例2 :pVAX-TMPRSS2载体构建 1、 从NCBI获取TMPRSS2 (BC_051839)基因的核苷酸序列； 2、 根据TMPRSS2基因序列设计引物，在上下游引物的5'端分别添加一段pVAX-Ι载体 的同源序列；
注：划线部分为载体同源序列 3、 从Calu-3细胞中提取RNA，反转录获得cDNA ; 4、 通过 PCR 扩增 TMPRSS2，PCR 反应条件为：94°C，2 min;94°C，30 s，58°C，30 s，72°C， 2 min，35 个循环；72°C，10 min ; 5、 Bam HI和Hind III双酶切pVAX-1载体，回收载体片段； 6、 将 PCR产物 20 ng和线性化载体pVAX-1 60 ng, 2XSeamLess Master Mix 混匀，加 水补足到10 yL，50°C反应连接15 min，置于冰上； 7、 取5 yL连接液加入50 yL刚刚融化的DH5a感受态细胞，轻柔混匀，冰浴2-30 min ； 8、 42°(：热激3〇8; 9、 立即放置于冰上2 min; 10、 加入500 μ L不含抗生素的SOC或LB培养液，37°C，250 rpm震荡培养I h; 11、 涂布含30 ng/mL卡那霉素的平板，37°C培养过夜； 12、 挑取菌落做PCR鉴定，阳性菌落测序验证，构建完成的pVAX-TMPRSS2载体鉴定如图 (4)所示。
[0027] 实施例3 :H7N9假病毒包装方案一 1、 在6孔板中接种4 X IO5个293T细胞，培养至80%铺满； 2、 将质粒 pNL-4. 3. luc. E-R-和 pVAX-HA 按照 3 :1 (单位：μ g)混合，加入 64 μ L solution Β(转染试剂组分，转染试剂由深圳盘然生物公司提供）混勾得solution 1; 3、 将128 μ L solution B与64 μ L solution A (转染试剂组分，转染试剂由圳盎然生 物公司提供）混勾得solution 2; 4、 将solution 2滴加到solution 1中，轻柔吹打混勾，室温静置30 min ; 5、 将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37°C培养； 6、 5h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的含0. 5 μ g/ml来源的细菌的神经 氨酸酶的Opti-DMEM培养液； 7、 继续培养48 h，收获上清液，1000 Xg离心10 min去除细胞碎片，0.45 μπι滤器过滤 后保存于_80°C。
[0028] 实施例4 :H7N9假病毒包装方案二 1、 在6孔板中接种4 X IO5个293T细胞，培养至80%铺满； 2、 将质粒 pNL-4. 3. luc. E-R-，pVAX-HA，pVAX-NA 按照 3 :1 :1 (单位：μ g)混合，加入 64 μ L solution B 混勾得 solution I ； 3、 将 128 μ L solution B 与 64 μ L solution A 混勾得 solution 2; 4、 将solution 2滴加到solution I中，轻柔吹打混勾，室温静置30 min ; 5、 将DNA-脂质体复合物逐滴滴加到293T细胞培养液中，37°C培养； 6、 5 h后弃培养液，用PBS冲洗细胞一次，更换新鲜的Opti-DMEM培养液； 7、 继续培养48 h，收获上清液，1000 Xg离心10min去除细胞碎片，0. 45 μπι滤器过滤 后保存于_80°C。
[0029] 实施例5 :H7N9假病毒包装方案三 1、 在6孔板中接种4 X IO5个293T细胞，培养至80%铺满； 2、 将质粒 pNL-4. 3. luc. E-R-，pVA