通过敲除p53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法，属于医学动物 疾病模型领域。
【背景技术】
[0002] 淋巴瘤起源于淋巴结和淋巴组织，其发生与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产 生的免疫细胞恶变相关，是血液系统中的恶性肿瘤，据报道，人类淋巴瘤的发病率有逐年上 升的趋势，男性为1. 39/10万，女性为0. 84/10万，欧美国家及日本的发病率明显高于国 内，而且在城市的发病率远高于农村，以20岁至40岁的青壮年多见，一旦发病，治愈非常困 难，这在很大程度上危害了人类的生命健康。
[0003] P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因之一，是当前肿瘤分子生物学 研究的焦点，据相关资料报道，P53基因是人体的抑癌基因，科学家对基因的结构和功能做 了大量深入细致的研究发现，超过50%的人类肿瘤与P53基因的异常有关，P53基因失活 可诱导细胞生长停止、细胞凋亡、细胞分化以及DNA修复异常，从而导致肿瘤的形成，然而， 目前人类肿瘤的治疗方法主要依靠手术、放疗、化疗、免疫治疗及中西医结合治疗等治疗手 段，但是面临着治愈率极低、治疗成本昂贵等的问题，因此，人们越来越关注从"治本"上来 提高肿瘤治愈率，通过基因药物的研究治疗就成为了人类21世纪治愈肿瘤的必由之路。
[0004] 猪的主要生理结构、生化指标、代谢特点都与人极为相似，小型猪体形小，更利于 实验过程中的操作和管理，相对于猴等动物建立的疾病模型而言，繁殖更快、成本也较低， 在生命科学的研究中具有独特的优越性和应用价值，而通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型 猪疾病模型的方法目前还未见报道。
[0005] 猪等动物疾病模型的建立为人类淋巴瘤疾病的研究和治疗奠定了重要的物质基 础，对于开发人类淋巴瘤等相关疾病治疗的基因药物具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明提供了通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方 法，该方法操作简单、科学合理、可靠性高、且易于实现，为淋巴瘤以及相关疾病的发病机 理、基因治疗方法的研究提供了重要的参考。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明采用的方法：
[0008] 所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法具体步骤为：
[0009] 第一步、P53基因敲除TALEN质粒对的设计、组装及胞外活性检测
[0010] 1)根据NCBI上猪P53基因序列在第四外显子区域设计TALEN靶点；
[0011] 2)组装 TALEN 质粒 pCAG-pP53-L 和 pCAG-pP53-R，针对左边 TALEN 识别序 列：TCTGGAACAGCCAAGT，RVD 序列如下：NG HD NG NN NN NI NI HD NI NN HD HD NI NI NN NG;针对右边 TALEN 识别序列：CCCTCAAGGCCACTGAC，RVD 序列如下：HD HD HD NG HD NI NI NN NN HD HD NI HD NG NN NI HD，根据左右RVD序列分别对应组装成质粒pCAG-pP53-L和 pCAG-pP53-R ；
[0012] 3) TALEN质粒对的胞外活性检测，一个终止子在luciferase的编码区中央， Iuciferase没有活性，为检测TALEN剪切活性，将一个TALEN的靶点位置序列插在终止子 后，在TALEN的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活 性的Iuciferase ;通过与参照的比值变化反应TALEN剪切的活性水平；
[0013] 4)将获得的有活性的质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R去内毒素质粒大提，-20°C 保存备用；
[0014] 第二步、细胞转染、筛选及P53阳性细胞系的获得
[0015] 1)转染前3天复苏滇南小耳猪原代胎儿成纤维细胞，利用胰酶消化贴壁细胞，离 心收集细胞，收集细胞数为7 X IO5个，利用电击缓冲液进行悬浮，同时加入pCAG-pP53-L和 pCAG-pP53-R质粒，调节使最终体积为700ul，再将混合液放入到0. 4cm的电击杯中，选择方 波，在电压250V，25ms条件下进行1次脉冲电击，将电击后的细胞悬浮液转移到IOOmm培养 皿中，加入DMEM，继续培养；
[0016] 2)转染48小时后，利用胰酶消化转染后贴壁的细胞，采用极度稀释培养法培养， 最终稀释为IOOul悬液中细胞的数目为95-105个，稀释培养10-13天细胞即可长成所需的 单细胞克隆；
[0017] 3)提取各细胞克隆DNA为模板，使用特异性引物进行扩增，将PCR产物通过T7E1 酶切和测序的方法，以确定各细胞克隆P53基因敲除情况，鉴定为双敲的细胞克隆继续培 养及冻存，留作体细胞核移植备用；
[0018] 第三步、体细胞核移植及胚胎移植
[0019] 1)卵母细胞的成熟培养
[0020] a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
[0021] b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0. lmg. ml 1丙酮酸、0. lmg. ml 1L-半胱氨酸盐酸、10%猪卵泡液、IOng. mL 1EGF的TCM-199成熟培养液滴 中，在5% C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h ;
[0022] 2)构建敲除P53基因的重构胚
[0023] a、取敲除P53基因的成纤维细胞，用含有0. 5% FBS的DMEM培养48h，使体细胞处 于6。或G i期；
[0024] b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用1透明质酸去除卵母细胞外围的 卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理〇. 5-lh，在操作液中用显微注 射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将敲除P53基因的成纤维体细胞导入到去核的卵 母细胞的卵间隙中；
[0025] 3)电融合和电激活重构胚
[0026] 再将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时 程为20 μ s的电融合参数下进行1次脉冲重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基 中培养2小时，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm脉冲电 压，脉冲时程为100 μ s的参数下进行1次电激活，重构胚移入含有2. 2ug. mL 1CB的培养液 中后放入含有5% C02、5% 02、38. 5°C的三气培养箱中平衡2h ;
[0027] 4)体外培养
[0028] 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养48h和7d 后分别观察记录重构胚胎的卵裂率，并用H〇echst33342对囊胚染色，测定囊胚的细胞数；
[0029] 5)选取自然发情的代孕母猪进行胚胎移植，将重构胚移植到其体内继续发育，待 代孕母猪妊娠约114天后分娩获得敲除P53基因的克隆仔猪；
[0030] 第四步、克隆猪P53基因敲除的验证
[0031] 仔猪出生后用手术剪刀剪取0.5X0. 5cm的耳组织，按照Tissue DNA Kit的 OMEGA，D3396-02步骤提取各仔猪DNA，使用特异性引物扩增靶点序列，通过T7E1酶切、测序 以判断各仔猪P53基因是否敲除；
[0032] 第五步、敲除P53基因克隆仔猪组织、器官中淋巴瘤的鉴定
[0033] 采用组织免疫学以及免疫组化染色的方法，鉴定小型猪中各组织器官中淋巴瘤的 发生以及形成情况。
[0034] 进一步地，在第一步1)中靶点序列为：
[0035] TCTGGAACAGCCAAGTCTGTAACCTGCACGGTCAGTGGCCTTGAGGGo
[0036] 进一步地，在第二步 1)中，加入 pCAG-pP53-L 和 pCAG-pP53-R 质粒各 10. 5ug。
[0037] 进一步地，其特征在于：在第二步1)中，加入的DMEM为IOml含10% FBS的DMEM。
[0038] 进一步地，在第三步2)b中，所用1透明质酸浓度为0. lmg. mL 1C3
[0039] 进一步地，在第三步4)中，所用Hoechst33342的浓度为5 μ g. mL 1O
[0040] 本发明的有益效果：通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪动物疾病模型，与利用 其他诱导方法建立的动物疾病模型相比，本模型的建立操作简单、实用性强、可控性高、复 制性好，可以从根本上阐明和研究淋巴瘤的致病机理和遗传机制，为淋巴瘤的"治本"药物 研究指明了研究方向；小型猪与小鼠、大鼠、兔等动物相比，小型猪的体型、血液循环量更 大，有利于胚胎移植中的手术操作，而且在体重、生理结构上与人极为相似，建立相应的疾 病模型指标与人的疾病临床指标更为相近，这为在不同水平上来探讨人类疾病的致病机制 以及遗传因素提供了依据，更利于在人类医学研究中复制和应用。
[0041] 本发明对参数的限定，在这个参数选择下，通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪 疾病模型的方法，不仅能够使得模型的建立周期较短，