表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种表达人白介素15的新型重组溶瘤 腺病毒及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤是威胁我国人民健康的重大疾病。传统手术、化疗和放疗只减低了肿瘤 负荷，无法根治肿瘤的复发和转移。由于恶性肿瘤的发生和发展有其分子遗传学基础，所以 基因疗法有望成为肿瘤治疗新的选择。其中，对腺病毒进行基因改造使其靶向杀伤肿瘤细 胞同时避免对正常细胞的影响（即溶瘤腺病毒），已经成为肿瘤基因治疗的新成员。
[0003] 为了实现溶瘤病毒的肿瘤靶向性，在其构建策略中，常常在病毒基因组中加载肿 瘤或组织特异性启动子以启动E1A、ElB或E4基因。由于E2F-1是一种在细胞周期的调节 过程中起重要作用的转录因子，其过表达既可引导静止期细胞进入分裂周期，也可以调控 许多与细胞分裂有关的转录因子的表达。利用E2F-1基因在大多数实体肿瘤高表达的特 点，构建以E2F-1基因作启动子调控ElA基因表达的溶瘤腺病毒能够选择性的在肿瘤细胞 中复制，而不影响正常细胞的功能，见CN00813593. 2。
[0004] 然而，由于机体存在抗病毒免疫，且肿瘤存在很强的免疫抑制网络，单纯溶瘤病毒 难以激发理想的免疫应答。最早被应用于临床试验的溶瘤病毒0NYX-015的试验数据表明 其作为单一疗法治疗肿瘤抑瘤作用并不明显，需要联合辅助疗法提高抗肿瘤作用。这促使 研究者在病毒基因组中插入免疫调苄基因使得病毒在直接杀伤肿瘤细胞的同时释放免疫 调节因子，优化抗肿瘤免疫反应，这成为抗肿瘤"病毒-基因"策略新方向。
[0005] 基于这一思路，我们注意到IL-15是T细胞产生细胞因子及其受体的化学诱导剂， 可以促进T细胞增殖，长时间维持扩增的CTL细胞的活力并增加其细胞毒性，同时促进T细 胞产生IFN-γ、TNF-α等细胞因子从而增强其杀瘤活性。在IL-15的功能研究中，已有实 验证实，IL-15不仅可以促进中性粒细胞、巨噬细胞的活性，对树突状细胞的功能起关键作 用；而且还可促进淋巴效应细胞，尤其是NK细胞、NKT细胞、B细胞和⑶8+Τ细胞的产生、激 活、归巢和存活。IL-15能够调节记忆性T细胞的存活和增殖，有效抑制Treg细胞对效应T 细胞的负向作用。因此，IL-15是非常具有潜力的用于肿瘤治疗的细胞因子，以此构建溶瘤 病毒或可取得良好抗肿瘤效果。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种表达人白介素15的新型重组溶瘤腺病毒及其构建方 法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供了一种表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒，其 是将5型腺病毒El区基因启动子替换成转录因子E2F-1基因 （GenBank :S74230)，且在Ε3 区插入人白介素15基因，即hIL-15基因 （GenBank :HSU14407)而构建得到的重组溶瘤腺病 毒。
[0008] 本发明的表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
[0009] 1)质粒PXC20-E2Fp的构建：用EcoRI和XhoI双酶切质粒P55-E2Fp，回收大小为 1088bp的DNA片段，同时用EcoRI和XhoI双酶切质粒PXC20,回收大小为8965bp的DNA片 段，将上述两个回收的DNA片段连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，涂布于含 AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正 确后命名为PXC20-E2Fp。
[0010] 2)质粒PENTER12-IL2SP-IL15的构建：根据hIL-15基因序列设计PCR扩增引物，
[0011] 上游引物：
[0012] 5 ' -ACGCGTCGACTTATCAAGAAGTGTTGATGAACATTTG-3 '，
[0013] 下游引物：
[0014] 5 ' -CCGGAATTCGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATT-3 '，
[0015] 以质粒hIL2SPIL15为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定正 确后，用EcoRI和Sail双酶切扩增产物，回收大小为477bp的DNA片段；再用EcoRI和Sail 双酶切质粒PENTER12,回收大小为3002bp的DNA片段，将上述两个回收的DNA片段连接，连 接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆于含AMP的LB 液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PENTER12-IL2SP-IL15。
[0016] 3)质粒 PPE3-IL2SP-IL15 的构建：质粒 pPE3-RC 与 pENTER12-IL2SP-IL15 进行 LR 重组反应，所得产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α，涂含AMP的琼脂平板，挑取阳性克隆 于含AMP的LB液体培养基中过夜培养，提质粒，酶切鉴定正确后命名为PPE3-IL2SP-IL15。
[0017] 4)重组溶瘤腺病毒的制备：将质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15共转染至 ΗΕΚ293细胞，转染后9-14天出现病毒空斑，经过病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA，进行PCR 鉴定。经鉴定正确的重组腺病毒命名为Ad-E2F1/IL15。
[0018] 前述的方法，步骤2)中进行PCR扩增hIL-15基因的反应条件为：94°C 5min; 94°C 40sec，56°C 40sec，68°C 90sec，共 30 个循环；68°C IOmin0
[0019] 前述的方法，步骤4)中质粒PXC20-E2Fp与PPE3-IL2SP-IL15通过 Lipofectamine2000 共转染至 HEK293 细胞。
[0020] 本发明还涉及所述重组溶瘤腺病毒或所述方法在制备抑制肿瘤生长的药物中的 应用。
[0021] 可选的，所述应用包括将所述重组溶瘤腺病毒与药物可接受的载体混合制备药 物。
[0022] 可选的，所述药物可接受的载体包括但不限于PBS缓冲液、生理盐水和细胞培养 液。其中，所述细胞培养液可以为含牛血清的1640培养液或DMEM培养液。
[0023] 本发明以E2F-1作为启动子实现病毒特异性在肿瘤细胞内复制的同时，在病毒基 因 E3区装载人IL-15基因可以进一步提高病毒抗肿瘤作用：（l)pRb/E2F通路缺陷广泛存 在于实体肿瘤中，通过病毒的溶瘤作用，可获得丰富的各种来自于个体自身的肿瘤抗原，且 不受抗原亚细胞定位的局限性，有利于产生具有自身肿瘤特异性的抗肿瘤免疫应答，具有 个性化和普遍性的治疗意义；（2)病毒复制过程中带动IL-15基因表达，在病毒感染的肿瘤 细胞局部获得高浓度的IL-15,有利于刺激免疫细胞的活性，激活全身免疫反应，增强抗肿 瘤效果。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中质粒PXC20-E2Fp的构建流程示意图。
[0025] 图2为本发明实施例1中质粒PXC20-E2Fp的酶切鉴定结果；其中A :Mix DNA Ladder ;B :EcoRI+XhoI 酶切，M :Mix DNA Ladder，1-6 为 PXC20-E2Fp 的 6 个克隆；C :M : Mix DNA LadderI, EcoRI+XhoI 8965bp+1088bp,2 ：AgeI+XhoI 9771bp+282bp, 3 ：EcoRV 9158bp+895bp，4 :HINDIII 6725bp+3328bp，5 :NheI+XbaI 8390bp+1163bp，6 :BstXI 6059bp+3672bp+322bp，7:HincII 5139bp+2581bp+2333bp，8 :PvuII 3473bp+2226bp+1861 bp+1482bp+908bp+76bp+27bp〇
[0026] 图3为本发明实施例1中质粒pENTER12-IL2SP-IL15的构建流程示意图。
[0027] 图4为本发明实施例1中LR重组反应示意图。
[0028] 图 5 为本发明实施例 1 中质粒 pENTER12-IL2SP-IL15 和 PPE3-IL2SP-IL15 的 酶切鉴定结果；其中，A :M :Mix DNA Ladder，M 左为 XbaI 酶切：2280bp+1199bp，M 右 为 XhoI+EcoRV 酶切：2633bp+846bp ;B :M1 :Mix DNA Ladder，M2 : ADNA EcoRI+Hindlll marker,I ：HindIII 8010bp+6034bp+5322bp+4597bp+4360bp + 2937bp+2791bp + 2 081bp+1522bp+75bp，2 :EcoRI 23815bp+8564bp+3159bp+2121bp+70bp，3 :XbaI 27716bp+7468bp+1346bp+1199bp，4 :BamHI 20674bp+14913bp+1741bp+401bp，5 :SalI 14221bp+6903bp+6037bp+6006bp+4183bp+379bp,6 ：SpeI 34330bp+3399bp,7 ：XhoI 14500bp+8322bp+4995bp+4908bp +2466bp+1445bp+595bp+498bp,8 ：EcoRV 8904bp+7637bp +4546bp+3840bp+2990bp+2623bp+2542bp+2052bp+1357bp+1238bp,9 ：NheI 11917bp+10342 bp+6192bp+4743bp+3848bp+687bp, 10 ：XbaI+SpeI 26206bp+7468bp+1510bp+1346bp+656bp +543bp,11 ：PacI 36422bp+991bp+316bp ；C ： λ DNA EcoRI+Hindlll marker〇
[0029] 图6为本发明实施例1中HEK293细胞内重组示意图。
[0030] 图7为本发明实施例1中溶瘤腺病毒Ad-E2F1/IL15的PCR鉴定结果；其中，N :阴 性对照；Pl :PXC20 质粒；P2 :PXC20-E2Fp 质粒；P3 :PPE3-IL2SP-IL15 质粒；1-2 :Ad-E2Fl/ IL15 病毒的 2 个克隆；M :Mix DNA Ladder。
[0031] 图8为本发明实施例1中重组腺病毒Ad-E2F1/IL15的DNA结构示意图。
[0032] 图9为本发明实施例1中重组腺病毒Ad-E2F1/IL15构建总流程图。
[0033] 图10为本发明实施例2中溶瘤腺病毒对细胞增殖的影响。
[0034] 图11为本发明实施例3中Ad-E2F1/IL15感染的细胞培养上清中IL-15蛋白含量。
[0035] 图12为本发明实施例4中不同重组腺病毒局部注射后肿瘤生长曲线比较。
[0036] 图13为HEK293细胞的培养。
[0037] 图14为病毒的扩增。
[0038] 图15为50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度。
【具体实施方式】
[0039] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0040] 实施例1表达人白介素15的重组溶瘤腺病毒及其构建方法
[0041] 1、实验材料及试剂
[0042] 质粒PXC20及腺病毒骨架质粒pPE3-RC由由上海东方肝胆外科医院病毒及基 因治疗实验室提供。携带hIL-15基因的质粒hIL2SPIL15。限制性内切酶EcoRI、Xhol、 Sail、PvuII、NcoI等购自美国NEB公司，DNA连接酶溶液I购自TakaRa公司，胶回收试剂 盒、PCR产物回收试剂盒、质粒DNA制备试剂盒、病毒DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司， LipofectAmine2000试剂盒购自GIBCO BRL公司。人胚肾293细胞（HEK293细胞）购自加 拿大MICROBIX BI0SYSTEMS公司，人结肠癌细胞系SW620和人胚胎成纤维细胞系Wi38由中 国人民解放军总医院普通外科研究所提供。MTT购自美国Sigma公司，IL15的ELISA检测 试剂盒购自美国BD公司。
[0043] 2、主要实验仪器
[0046] 3、实验方法