的成熟培养
[0087] a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
[0088] b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0. lmg. ml 1丙酮酸、0. lmg. ml 1L-半胱氨酸盐酸、10%猪卵泡液、IOng. mL 1EGF的TCM-199成熟培养液滴 中，在5% C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h ;
[0089] 2)构建敲除P53基因的重构胚
[0090] a、取敲除P53基因的成纤维细胞，用含有0. 5% FBS的DMEM培养48h，使体细胞处 于6。或G i期；
[0091] b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用1透明质酸去除卵母细胞外围的 卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理〇. 5-lh，在操作液中用显微注 射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将敲除P53基因的成纤维体细胞导入到去核的卵 母细胞的卵间隙中；
[0092] 3)电融合和电激活重构胚
[0093] 再将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时 程为20 μ s的电融合参数下进行1次脉冲重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基 中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm脉冲电压，脉 冲时程为100 μ s的参数下进行1次电激活，重构胚移入含有2. 2ug. mL 1CB的培养液中后放 入含有5% C02、5% 02、38. 5°C的三气培养箱中平衡2h ;
[0094] 4)体外培养
[0095] 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养48h和7d 后分别观察记录重构胚胎的卵裂率，并用H〇echst33342对囊胚染色，测定囊胚的细胞数；
[0096] 5)选取自然发情的代孕母猪进行胚胎移植，将重构胚移植到其体内继续发育，待 代孕母猪妊娠约114天后分娩获得敲除P53基因的克隆仔猪；
[0097] 第四步、克隆猪P53基因敲除的验证
[0098] 仔猪出生后用手术剪刀剪取约0. 5X0. 5cm的耳组织，按照Tissue DNA Kit的 OMEGA，D3396-02步骤提取各仔猪DNA，使用特异性引物扩增靶点序列，通过T7E1酶切、测序 以判断各仔猪P53基因是否敲除；
[0099] 第五步、敲除P53基因克隆仔猪组织、器官中淋巴瘤的鉴定
[0100] 采用组织免疫学以及免疫组化染色的方法，鉴定小型猪中各组织器官中淋巴瘤的 发生以及形成情况。
[0101] 实施例2:
[0102] 所述的通过敲除P53基因获得淋巴瘤小型猪疾病模型的方法具体步骤为：
[0103] 第一步、P53基因敲除TALEN质粒对的设计、组装及胞外活性检测
[0104] 1)根据NCBI上猪P53基因序列在第四外显子区域设计TALEN靶点，靶点序列为：
[0105] TCTGGAACAGCCAAGTCTGTAACCTGCACGGTCAGTGGCCTTGAGGG ；
[0106] 2)组装 TALEN 质粒 pCAG-pP53-L 和 pCAG-pP53-R，针对左边 TALEN 识别序 列：TCTGGAACAGCCAAGT，RVD 序列如下：NG HD NG NN NN NI NI HD NI NN HD HD NI NI NN NG;针对右边 TALEN 识别序列：CCCTCAAGGCCACTGAC，RVD 序列如下：HD HD HD NG HD NI NI NN NN HD HD NI HD NG NN NI HD，根据左右RVD序列分别对应组装成质粒pCAG-pP53-L和 pCAG-pP53-R ；
[0107] 3) TALEN质粒对的胞外活性检测，一个终止子在luciferase的编码区中央， Iuciferase没有活性，为检测TALEN剪切活性，将一个TALEN的靶点位置序列插在终止子 后，在TALEN的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活 性的Iuciferase ;通过与参照的比值变化反应TALEN剪切的活性水平；
[0108] 4)将获得的有活性的质粒pCAG-pP53-L和pCAG-pP53-R去内毒素质粒大提，-20°C 保存备用；
[0109] 第二步、细胞转染、筛选及P53阳性细胞系的获得
[0110] 1)转染前3天复苏滇南小耳猪原代胎儿成纤维细胞，利用胰酶消化贴壁细胞，离 心收集细胞，收集细胞数为7 X IO5个，利用电击缓冲液进行悬浮，同时加入pCAG-pP53-L和 pCAG-pP53-R质粒各10. 5ug，调节使最终体积为700ul，再将混合液放入到0. 4cm的电击杯 中，选择方波，在电压250V，25ms条件下进行1次脉冲电击，将电击后的细胞悬浮液转移到 IOOmm培养皿中，加入IOml含10% FBS的DMEM，继续培养；
[0111] 2)转染48小时后，利用胰酶消化转染后贴壁的细胞，采用极度稀释培养法培养， 最终稀释为IOOul悬液中细胞的数目为95-105个，稀释培养10-13天细胞即可长成所需的 单细胞克隆；
[0112] 3)提取各细胞克隆DNA为模板，使用特异性引物进行扩增，将PCR产物通过T7E1 酶切和测序的方法，以确定各细胞克隆P53基因敲除情况，鉴定为双敲的细胞克隆继续培 养及冻存，留作体细胞核移植备用；
[0113] 第三步、体细胞核移植及胚胎移植
[0114] 1)卵母细胞的成熟培养
[0115] a、从屠宰场采集猪的卵巢并在4h内运回实验室；
[0116] b、挑选直径为3-6mm的卵泡从中抽取卵丘-卵母细胞复合体，放入添加0. lmg. ml 1丙酮酸、0. lmg. ml 1L-半胱氨酸盐酸、10%猪卵泡液、IOng. mL 1EGF的TCM-199成熟培养液滴 中，在5% C02,38. 5°C的培养箱中培养38-42h ;
[0117] 2)构建敲除P53基因的重构胚
[0118] a、取敲除P53基因的成纤维细胞，用含有0. 5% FBS的DMEM培养48h，使体细胞处 于6。或G i期；
[0119] b、卵丘-卵母细胞复合体经体外成熟培养后，用0. lmg.mL 1I透明质酸去除卵母细 胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0. 5-lh，在操作液中 用显微注射针将极体及其周围胞质一起吸去，然后将敲除P53基因的成纤维体细胞导入到 去核的卵母细胞的卵间隙中；
[0120] 3)电融合和电激活重构胚
[0121] 再将每批约20枚重构胚胎，移入融合液中清洗三遍，在25V/mm脉冲电压，脉冲时 程为20 μ s的电融合参数下进行1次脉冲重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基 中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后在150V/mm脉冲电压，脉 冲时程为100 μ s的参数下进行1次电激活，重构胚移入含有2. 2ug. mL 1CB的培养液中后放 入含有5% C02、5% 02、38. 5°C的三气培养箱中平衡2h ;
[0122] 4)体外培养
[0123] 将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养48h和7d 后分别观察记录重构胚胎的卵裂率，并用5 μ g. mL 1的H〇echst33342对囊胚染色，测定囊胚 的细胞数；
[0124] 5)选取自然发情的代孕母猪进行胚胎移植，将重构胚移植到其体内继续发育，待 代孕母猪妊娠约114天后分娩获得敲除P53基因的克隆仔猪；
[0125] 第四步、克隆猪P53基因敲除的验证
[0126] 仔猪出生后用手术剪刀剪取约0. 5X0. 5cm的耳组织，按照Tissue DNA Kit的 OMEGA，D3396-02步骤提取各仔猪DNA，使用特异性引物扩增靶点序列，通过T7E1酶切、测序 以判断各仔猪P53基因是否敲除；
[0127] 第五步、敲除P53基因克隆仔猪组织、器官中淋巴瘤的鉴定
[0128] 采用组织免疫学以及免疫组化染色的方法，鉴定小型猪中各组织器官中淋巴瘤的 发生以及形成情况。
[0129] 实施例2对本发明参数的限定，在这个参数选择下，通过敲除P53基因获得淋巴瘤 小型猪疾病模型的方法，不仅能够实现P53基因敲除建立模型的周期短，淋巴瘤的发病和 形成较明显的优点，而且对于研究淋巴瘤的发病机制和治疗策略具有重要的参考价值，利 于模型在人类医学中的推广和应用。
[0130] 实验分析：
[0131] 1、对所得的细胞进行是否敲除P53基因的检测见表1
[0132] 表 1
[0133] CN 105177044 A 说明书 9/11 页
[0135] 我们得到的细胞克隆中8个发生了双等位P53基因移码突变，说明这些细胞克隆 均已经成功敲除P53基因。
[0136] 2、基因型测序验证6头出生的克隆猪的碱基系列都与所用供体细胞
[0137] 12号的碱基对比见表2
[0138]