一种苦瓜白粉病菌的保存方法
【专利摘要】本发明公开一种苦瓜白粉病菌的保存方法，是将病叶上的白粉菌接种到易感病的离体苦瓜叶片上，待叶片上产生新的白粉层后，挑出单个孢子或单条孢子梗，接种到无菌苗的离体叶片上进行纯化，产生新菌落后再接种到无菌苦瓜子叶上，待子叶表面产生新菌落时，再密封保存。在离体条件下，本方法可保存苦瓜白粉病菌150d以上。本发明是在人工条件下对苦瓜白粉病的进行纯化和保存，本方法具有占用空间小，保存时间可控的优点，本发明为苦瓜白粉病的鉴定和防治，苦瓜抗白粉病新品种的选育和苦瓜白粉病菌生物学研究提供了极大方便，具有较高的应用价值。
【专利说明】一种苦瓜白粉病菌的保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病理【技术领域】中一种专性寄生菌的保存方法，尤其是涉及一种苦瓜白粉病菌的保存方法。
【背景技术】
[0002]苦瓜(Momordica charantia L.),又名凉瓜,是葫芦科一年生攀缘草本植物。苦瓜是人们喜爱的一种蔬菜，原产地中国。在东南亚、中国、和加勒比海群岛均有广泛的种植。随着苦瓜种植面积和规模的逐渐扩大，苦瓜病害发病率也日益严重。
[0003]苦瓜白粉病是苦瓜生产中常见的主要病害之一,属于气候性病害,主要在春秋两季爆发流行，由于白粉病菌是一种专性寄生菌，只能寄生于活体寄主植物上，不能在人工培养基上培养，因此难以在离体的条件下进行纯化和长期的保存。现有技术报道中的一些关于苦瓜白粉病菌的纯化和保存方法大都是在春秋白粉病流行季节，将白粉病菌接种到感病的寄主植物上进行多次单对单转接纯化并保存，保存期限大概一个月左右。此类方法具有受环境和季节影响，占用空间大，工作量大和保存时间短的缺点，同时由于田间的白粉病菌含有大量杂菌造成纯度较低，不能满足后续研究工作的需求，比如白粉病菌鉴定、分子生物学研究、杀菌剂研制等都需要大量的纯化的活体致病菌。因此，迫切需要一种高效的苦瓜白粉病菌的纯化和保存方法。
【发明内容】
[0004]本发明根据苦瓜的白粉病菌只能寄生于活体植物上的特点，提供一种苦瓜白粉病菌离体条件下的保存方法。
[0005]为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现的:
[0006]一种苦瓜白粉病菌的保存方法，是将田间发病叶上的白粉菌接种到易感病的健康离体苦瓜叶片表面，置于28°C /16h、20°C /8h光暗交替条件下保湿培养，产生新的白粉层后，在无菌条件下，挑出单个孢子或单条孢子梗，接种到无菌苗的离体叶片上纯化，产生新菌落后接种到无菌苦瓜子叶上，待子叶表面产生新菌落时，再置于温度10°C?12°C、8h/16h光暗交替的条件下密封保存，在离体条件下，本方法可以保存白粉病菌150d以上。
[0007]本发明所提供的技术方案，其步骤如下:
[0008](I)苦瓜白粉病菌的诱导:先将苦瓜病叶上的白粉菌接种到健康离体苦瓜叶片上，然后将离体苦瓜叶片放入培养皿中，密封置于光暗交替条件下保湿培养，诱导新的白粉病菌；
[0009](2)苦瓜无菌叶片和无菌子叶的准备:将易感病材料的种子消毒后接种于培养基中，获得无菌苗后，将长至宽3cm左右的叶片切下放入培养皿中待用；从下胚轴Icm处切下带子叶的茎段并去掉侧芽，插入每孔盛有3ml营养液的12孔细胞培养板孔内，将细胞培养板放入消毒的带盖盒子中待用；
[0010](3)苦瓜白粉病菌的纯化:在无菌条件下，将诱导新生成的白粉病菌，在解剖镜下挑出单个孢子或单根孢子梗，接种到准备好的无菌苗离体叶片上，密封置于光暗交替条件下保湿培养纯化；
[0011](4)苦瓜白粉病菌的保存:将纯化后的白粉病菌接种到插入盛有营养液的细胞培养板孔内的无菌子叶上，再将细胞培养板放入消毒的带盖盒子中，密封置于光暗交替条件下进行培养，待子叶表面生产新的菌落后，再置于温度10°c?12°C、光暗8h/16h条件下保存。
[0012]作为优选，步骤⑴中所述叶片为易感病材料侧枝上新生的第4?5张且小于9cm的幼嫩叶片。
[0013]作为优选，步骤(I)、(3)中所述光暗交替条件为281:/1611，201:/811，光照强度为2000Luxo
[0014]作为优选，步骤(4)所述光暗交替条件为温度10°C?12°C、光暗8h/16h，光照强度为 2000Lux。
[0015]作为优选，步骤(2)中所述培养基为外加蔗糖20g/L、琼脂7g/L的MS培养基；所述营养液为外加苯并咪唑100g/L、蔗糖15g/L的1/2MS培养基，其中1/2MS为大量元素减半的MS培养基。
[0016]本发明的有益.效果
[0017]1、本发明利用苦瓜子叶生命周期长的特点，将纯化后的白粉病菌在苦瓜子叶上进行保存，打破了环境和季节对白粉病发病的制约，本发明的保存方法具有占用空间小、保存时间长的优点。
[0018]2、本发明解决了当前苦瓜白粉病菌保存时间短的问题，为苦瓜白粉病的鉴定和防治，苦瓜抗白粉病新品种的选育以及苦瓜白粉病菌生物学研究提供极大方便，具有较高的应用价值。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0020]实施例
[0021]1、供试的植物材料
[0022]纯化白粉病菌用的苦瓜离体叶片为田间采集易感病材料MC105侧枝上新生的第4张且小于9cm的健康幼嫩叶片；纯化用的无菌离体叶片和保存用的子叶为易感病的苦瓜材料MC105种子播种于MS培养基中所获得。
[0023]2、实施步骤
[0024]2.1苦瓜白粉病菌的采集和分离
[0025]田间采集感病材料MC105尚保持绿色的病叶，将白粉菌接种到健康离体苦瓜叶片上，将离体叶片放入装有滤纸的培养皿中，密封置于28°C /16h，20°C /8h的条件下光暗交替保湿培养诱导新的白粉病菌。待第4d可观察到叶表面产生新的模糊白粉层，第7?1d的白粉层加厚，即可用于纯化。
[0026]2.2苦瓜无菌叶片和无菌子叶的准备
[0027]将易感病材料MC105的种子消毒后接种于外加蔗糖20g/L、琼脂7g/L的MS培养基中，第5d种子萌发，获得无菌苗，第1d左右时将长至宽3cm左右的叶片切下放入装有无菌滤纸的培养皿中待用；从下胚轴Icm处切下带子叶的茎段并去掉侧芽，插入每孔盛有3ml营养液的12孔细胞培养板孔内，不盖盖子，将细胞培养板放入消毒的带盖盒子中待用。
[0028]2.3苦瓜白粉病菌的纯化
[0029]在无菌条件下将诱导新生成的白粉病菌，在解剖镜下挑出单个孢子或单条孢子梗，接种到无菌苗离体叶片上，密封置于28°C /16h，20°C /8h的条件下光暗交替保湿培养纯化，第7d左右，用肉眼可见新产生的菌落。
[0030]2.4苦瓜白粉病菌的保存
[0031]将纯化的白粉病菌接种到无菌子叶上，将不盖盖子的细胞培养板放入消毒的带盖盒子中，密封后置于28°C /16h，20°C /8h的条件下光暗交替培养，第1d左右，子叶表面产生新的菌落，然后置于温度10°C?12°C、光暗8h/16h条件下保存。
[0032]3、苦瓜白粉病菌保存效果
[0033]接菌的子叶在温度10°C?12°C、光暗8h/16h条件下保存，150d子叶仍能保持较青绿，说明此时的子叶还是白粉病菌的活体寄主植物，把接菌子叶置于28°C /16h，20°C /8h的条件下光暗交替恢复生长3d，将子叶上的白粉菌接种到健康的易感苦瓜材料叶片上，致病效果跟前述一样，说明在子叶上保存了 150d的白粉病菌仍有较强的致病力。
[0034]前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【权利要求】
1.一种苦瓜白粉病菌的保存方法，其具体步骤如下: (1)苦瓜白粉病菌的诱导:先将苦瓜病叶上的白粉菌接种到健康离体苦瓜叶片上，然后将离体苦瓜叶片放入培养皿中，密封置于光暗交替条件下保湿培养，诱导新的白粉病菌； (2)苦瓜无菌叶片和无菌子叶的准备:将易感病材料的种子消毒后接种于培养基中，获得无菌苗后，将长至宽3cm左右的叶片切下放入培养皿中待用；从下胚轴Icm处切下带子叶的茎段并去掉侧芽，插入每孔盛有3ml营养液的12孔细胞培养板孔内，将细胞培养板放入消毒的带盖盒子中待用； (3)苦瓜白粉病菌的纯化:无菌条件下，将诱导新生成的白粉病菌，在解剖镜下挑出单个孢子或单条孢子梗，接种到准备好的无菌苗离体叶片上，密封置于光暗交替条件下保湿培养纯化； (4)苦瓜白粉病菌的保存:将纯化后的白粉病菌接种到插入盛有营养液的细胞培养板孔内的无菌子叶上，再将细胞培养板放入消毒的带盖盒子中，密封置于光暗交替条件下进行培养，待子叶表面生产新的菌落后，再置于温度10?12°C，光暗8h/16h条件下保存。
2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于:步骤(I)中所述叶片为易感病材料侧枝上新生的第4?5张且小于9cm的幼嫩叶片。
3.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于:步骤(I)和(3)中所述光暗交替条件为28 V /16h，20°C /8h ;步骤(4)中所述光暗交替条件则为温度10?12°C，光暗8h/16h，光照强度均为2000LUX。
4.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于:步骤(2)中所述培养基为外加蔗糖20g/L、琼脂7g/L的MS培养基；所述营养液为外加苯并咪唑100g/L、蔗糖15g/L的1/2MS培养基，其中1/2MS为大量元素减半的MS培养基。
【文档编号】C12N1/04GK104293670SQ201410583749
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】黄如葵, 陈小凤, 黄熊娟, 刘萌芽, 黄玉辉, 冯诚诚, 陈振东, 梁家作, 刘杏连, 车江旅 申请人:广西壮族自治区农业科学院蔬菜研究所