专利名称：一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及其培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于植物病理技术领域，尤其是涉及一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及
其培养基。
背景技术：
橡胶树白粉病是由橡胶树粉孢属(oidium heveae B. A. Steinm)真菌侵染引起的 巴西橡胶树最重要叶部病害之一，自从1918年在印度尼西亚爪哇首次发现以来，迄今已遍 布全球各橡胶种植区。发病严重时，白粉病引起橡胶树落叶、落花，使胶乳减产、橡胶树生势 衰弱，新梢枯死，对橡胶树生长和产量影响非常大。橡胶树白粉病作为一种气候病害，主要在春季气候冷凉、阴湿的条件下爆发流行， 且橡胶树白粉菌属于专性寄生菌，在人工配制的培养基上不能生长，只能在鲜活的植物组 织材料上培养和保存。研究所需的橡胶树白粉病材料，只有在春季白粉病爆发时从大田中 采集。因此，橡胶树白粉病存在受自然条件影响大、存在时间短、不容易控制保存等缺陷，给 研究带来不便。在橡胶树白粉病的病害鉴定、抗病育种等实验研究中，人工培养和保存橡胶树白 粉病的方法主要是在保证温湿度的条件下，将橡胶树白粉病孢子接种在橡胶树袋装苗的幼 嫩叶片上，使其发病保存。但袋装苗保存法存在占地面积较大，可使用的幼嫩叶片较少等缺 点，很难达到试验需求。
发明内容
本发明提供一种简便、长期高效、规模较大的橡胶树白粉病菌培养保存的方法，利 用保鲜营养液使橡胶树叶片保持较长时间生活力，实现了橡胶树白粉病菌在叶片上的离体 培养，解决了橡胶树白粉病菌的培养和保存问题。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案—种橡胶树白粉病菌离体培养方法，包括步骤A)营养液和培养盘准备Al、配制营养液氯化钙100 200mg/L、6-苄氨基嘌呤5 10mg/L、水杨酸10 80mg/L、维生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸钠0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS 培养基大量元素，所述0. 2倍MS培养基大量元素包括硝酸铵3. 3g/L、硝酸钾3. 8g/L、二水 氯化钙0. 88g/L、七水硫酸镁0. 74g/L、磷酸二氢钾0. 34g/L ；A2、在无菌培养盘中装入过40目或以下细筛的细沙，以不超过沙面的无菌水保持 细沙湿润，将PCR板置于沙中，用移液枪转营养液入PCR板孔内；B)离体叶片准备Bi、选择橡胶树处于变色期的幼嫩叶片；B2、将采集的新鲜橡胶树叶片用无菌水冲洗二至三遍后，在0. 3-0. 5%次氯酸钠溶 液中浸泡3-5分钟，再用无菌水冲洗二至三遍，浙干；
C)将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，用在75%酒精中消毒晾 干后毛笔或毛刷轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌至经过营养液处理的离体叶片上，置于 23°C、湿度为90%的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。本发明目的之二在于提供一种用于橡胶树白粉病菌离体培养的培养基，包括氯化钙100 200mg/L、6-苄氨基嘌呤5 10mg/L、水杨酸10 80mg/L、维生素 C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸钠0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS培养基大量元素 (硝酸铵3. 3g/L、硝酸钾3. 8g/L、二水氯化钙0. 88g/L、七水硫酸镁0. 74g/L、磷酸二氢钾 0. 34g/L)。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明通过大量的探索研究，配置出能使橡胶树离体叶片保持较长时间生活力的 保鲜营养液(培养基)，通过6-苄氨基嘌呤、水杨酸、维生素C与0. 2倍MS培养基大量元素 协同作用，模拟橡胶树白粉病菌最佳生长环境，实现了橡胶树白粉病菌在叶片上的离体培 养，解决了橡胶树白粉病菌的培养和保存问题。本发明所述方法简单，操作方便，占用空间 小，通过橡胶树离体叶片进行白粉病菌培养，能在短期内繁殖出大量的白粉病菌用于橡胶 树种质资源的人工接种，解决橡胶树白粉病抗性鉴定的重要问题，并促进橡胶树白粉病形 态学、生物学和分子生物学的研究，为即时、高效地开展橡胶树白粉病菌研究奠定了基础。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。1、离体叶片准备A、选择橡胶树处于变色期的幼嫩叶片；B、将采集的新鲜橡胶树叶片用无菌水冲洗三遍后，在0. 5%次氯酸钠溶液中浸泡 5分钟，再用无菌水冲洗三遍，浙干；2、菌种选择选择橡胶树病叶上新鲜的橡胶树白粉病无性分生孢子；3、营养液和培养盘准备A、采用如下配方配制营养液氯化钙100 200mg/L、6-苄氨基嘌呤5 10mg/L、 水杨酸10 80mg/L、维生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸钠0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/ L、0. 2倍MS培养基大量元素(硝酸铵3. 3g/L、硝酸钾3. 8g/L、二水氯化钙0. 88g/L、七水硫 酸镁0. 74g/L、磷酸二氢钾0. 34g/L)；B、在白磁盘中装入过40目筛的细沙，以不超过沙面的无菌水保持细沙湿润，将 PCR板置于沙中，用移液枪转营养液入PCR板孔内；4、接种培养将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，毛笔在75%酒精中消毒晾干 后，轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌于经过营养液处理的离体叶片上，置于23°C、湿度为 90%的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。本实施例所述橡胶树白粉病菌离体培养方法1、实现了白粉病菌离体培养，可快速、长期培养保存橡胶树白粉病菌。橡胶树白粉 病菌是一种专性寄生菌，只能寄生在鲜活的橡胶树嫩叶、嫩芽、嫩梢和花序上，且生长条件 严格，在自然界中常常因为温度、湿度和橡胶树物候期等原因很难获得大量的橡胶树白粉病病菌。本方法克服了橡胶树白粉病病害研究受气候、物候等外部条件制约的困难，可以长 期、快捷地培养可用于研究的橡胶树白粉病病菌。 2、实现了白粉病菌的规模化培养。本方法操作简单，占用空间小，采集巴西橡胶树 嫩叶，利用人工培养箱短期就可繁殖出大量白粉病菌，如此规模化的病菌离体培养是进行 橡胶树白粉病研究的有效手段。
权利要求
1.一种橡胶树白粉病菌离体培养方法，包括步骤A)营养液和培养盘准备Al、配制营养液氯化钙100 200mg/L、6-苄氨基嘌呤5 10mg/L、水杨酸10 80mg/ L、维生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸钠0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS培养基 大量元素(硝酸铵3. 3g/L、硝酸钾3. 8g/L、二水氯化钙0. 88g/L、七水硫酸镁0. 74g/L、磷酸 二氢钾 0. 34g/L)；A2、在无菌培养盘中装入过40目或以下细筛的细沙，以不超过沙面的无菌水保持细沙 湿润，将PCR板置于沙中，用移液枪转营养液入PCR板孔内；B)离体叶片准备Bi、选择橡胶树处于变色期的幼嫩叶片；B2、将采集的新鲜橡胶树叶片用无菌水冲洗二至三遍后，在0. 3-0. 5%次氯酸钠溶液中 浸泡3-5分钟，再用无菌水冲洗二至三遍，浙干；C)将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，用在75%酒精中消毒晾干后毛 笔或毛刷轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌至经过营养液处理的离体叶片上，置于23°C、 湿度为90%的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。
2.一种用于橡胶树白粉病菌离体培养的培养基，包括氯化钙100 200mg/L、6-苄氨基嘌呤5 10mg/L、水杨酸10 80mg/L、维生素C 0. 2 0. 8mg/L、硫代硫酸钠0. 2 0. 8g/L、活性炭1 5g/L、0. 2倍MS培养基大量元素，所 述0. 2倍MS培养基大量元素包括硝酸铵3. 3g/L、硝酸钾3. 8g/L、二水氯化钙0. 88g/L、七 水硫酸镁0. 74g/L、磷酸二氢钾0. 34g/L。
全文摘要
本发明公开了一种橡胶树白粉病菌离体培养方法及其培养基，属于植物病理技术领域。本发明所述的橡胶树白粉病菌离体培养方法，包括步骤A)营养液和培养盘准备B)离体叶片准备C)将处理后的离体叶片插入装有营养液的PCR板孔内，用在75％酒精中消毒晾干后毛笔或毛刷轻刷感病橡胶树叶片上的白粉病菌至经过营养液处理的离体叶片上，置于23℃、湿度为90％的人工气候箱中，每天进行16小时光培养，8小时暗培养。本发明所述的橡胶树白粉病菌离体培养方法简便、长期高效，能大规模培养橡胶树白粉病菌，实现了橡胶树白粉病菌在叶片上的离体培养，解决了橡胶树白粉病菌的培养和保存问题。
文档编号C12R1/645GK102002464SQ201010531470
公开日2011年4月6日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者华玉伟, 涂敏, 蔡海滨, 黄华孙 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所