一种稳定沉默fgfr4基因表达的肝癌细胞株的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种沉默FGFR4基因表达稳定肝癌细胞株的构建方法。构建方法：一，针对人FGFR4基因序列，设计合成3对最佳miRNA的oligo靶序列，分别退火的产物与干扰载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP进行连接反应，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证。二，将质粒转染到FGFR4高表达细胞，通过实时荧光定量PCR和Western blot检测各组FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达情况，筛选出对肝癌细胞株FGFR4基因沉默效果最明显的miRNA靶点。转染后可作为一种稳定沉默FGFR4基因的肝癌细胞株，用于进一步研究FGFR4在肝癌发生发展中的基因功能。
【专利说明】
一种稳定沉默FGFR4基因表达的肝癌细胞株的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种沉默FGFR4基因 RNAi表达质粒及 其制备方法与筛选。
【背景技术】
[0002] 肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一， 病死率极高。成纤维细胞生长因子受体4 (Fibroblast growth factor receptor 4, FGFR4) 是免疫球蛋白基因超家族成员，也是唯一存在于成熟静息状态肝细胞上的FGFR。很多研究 提示FGFR4在肝癌中可能行使癌基因的角色，但其作用机制尚待深入研究。
[0003] 近年来，基因阻断技术的研究取得了很大的进展。由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发，同源mRNA高效特异性降解的现象被称为RNA干扰（RNA interference RNAi)。RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在恶性肿瘤基因治疗领域发展极为 迅速。我们利用RNAi技术，构建靶向沉默FGFR4表达的RNAi质粒载体，从而建立稳定沉默 FGFR4基因表达的肝癌细胞株，以期为进一步研究FGFR4基因在肝癌发展中的功能奠定基 础。
【发明内容】
[0004] 本发明针对人FGFR4基因序列设计并合成3个miRNA干扰片段，构建3个miRNA 干扰载体，转染FGFR4高表达肝癌细胞株并筛选出沉默效果最佳的miRNA质粒表达载体，从 而建立稳定沉默FGFR4基因的细胞株。
[0005] FGFR4-miRNA的表达载体构建和鉴定：针对人FGFR4基因序列，设计3条最佳的靶 点序列，根据待用miRNA的结构特征，合成3对miRNA的oligo序列。将合成好的3个革巴点 的miRNA oligo序列分别退火的产物与线性化的干扰载体pcDNA?6. 2-GW/EmGFP(见图1. 2) 进行连接反应，连接完成后为miRNA表达载体pcDNA?6. 2-GW/EmGFP-miR-neg(见图3)，转 化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序验证（见图4)。
[0006] 沉默效果最佳的miRNA质粒表达载体的筛选：
[0007] 将3个miRNA质粒和阴性对照空质粒转染到FGFR4高表达细胞，用荧光显微镜观 测各组转染细胞GFP表达情况（见图5)。实时荧光定量PCR检测各组FGFR4mRNA水平的干 扰效果（见图6) ;WeStern blot检测各组FGFR4蛋白表达情况（见图7)。成功筛选出对 肝癌细胞株FGFR4基因沉默效果最明显的miRNA质粒表达载体，结果初步选定FGFR4-miR-l 的沉默效果最佳，转染后可作为一种稳定沉默FGFR4基因的肝癌细胞株，用于以FGFR4为基 因靶点的肿瘤治疗研究。
【附图说明】
[0008] 图1是干扰靶点结构；
[0009] 图2是干扰载体；
[0010] 图3是miRNA表达载体图谱；
[0011] 图4是测序结果；
[0012] 图5是转染图；A-转染空载体，B-转染FGFR4-miR-l表达载体，C-转染连 FGFR4-miR-2表达载体，D-转染FGFR4-miR-l表达载体
[0013] 图6是实时荧光定量PCR筛选；P1-转染FGFR4-miR-l连接载体组，P2-转染 FGFR4-miR-2连接载体组，P3-转染FGFR4-miR-3连接载体组，P0-未转染干扰载体组， P(NC)_转染未连接的空质粒组，其中P1的沉默效果最为明显。（*P < 0. 001)
[0014] 图7是Western blot筛选；P(NC)_转染未连接的空质粒组，P0-未转染干扰载 体组，P1-转染FGFR4-miR-l连接载体组，P2-转染FGFR4-miR-2连接载体组，P3-转染 FGFR4-miR-3连接载体组，其中P1组蛋白水平表达降低最明显，故为沉默效果最佳的细胞 株。
【具体实施方式】
[0015] -载体构建
[0016] 1，根据基因序列分别设计并合成3对miRNA oligo, oligo序列如下：
[0019] 2,线性miRNA载体与oligo双链的连接
[0020] 1)将设计好的3对（6条）oligo用ddH20溶解成50 μM。
[0021] 2)3对oligo的各两条链两两退火，退火体系如下：
[0022]
[0023] 3)取1 μ 1退火的ds Oligo,加99 μ 1的ddH20，稀释100倍，并混合均匀。
[0024] 4)将线性化的miRNA载体（图2)与oligo双链的连接，连接体系如下：
[0025]
[0026] 3,将上述连接产物（图3)取5 μ 1转化感受态大肠杆菌DH5 α，转化步骤如下：
[0027] 1)将5 μ 1连接产物加入15 μ 1的DH5 α感受态细胞中，冰中静置30min。
[0028] 2) 42°C热激 90s，冰上放置 2min。
[0029] 3)加入 500 μ 137°C 预热的 LB 液体培养基，37°C，220rpm 培养 45min。
[0030] 4)3500rpm离心5min，吸去上清400 μ1，用枪吹匀后1涂于含50mg/L壮观霉素 (Spe+)的平板上，37°C培养过夜。
[0031] 4,在每块板上各挑取2个菌斑，接入含50mg/L的含Spe+的LB培养基中，37°C摇 菌过夜，次日抽提质粒，送测序（图4)。
[0032] 5,按照 Lipofectamine?2000 (Invitrogen)说明步骤进行转染：
[0033] 1)取6孔培养板，向每孔中加入2ml含细胞浓度为1 X 105个/ml的含血清不含抗 生素的培养液，371：0)2培养至40%到60%汇合。
[0034] 2)转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两种液体（为转染每孔细胞所用的量）
[0035] A液：用不含血清培养基稀释10 μ gDNA，终量100 μ 1 ;
[0036] Β液：用不含血清培养基稀释50 μ 1LR，终量100 μ 1。轻轻混合Α，Β液，室温中放 置 20min。
[0037] 3)转染准备：用2ml不含血清培养液漂洗两次，再加入1ml不含血清的培养液。
[0038] 4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37°C温箱放置24小时，检测报告 基因活性（图5)，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
[0039] 二实时荧光定量PCR进行筛选
[0040] 1，细胞总RNA的提取
[0041] 1)6孔板每孔细胞中加入lmlTrizol试剂，冰上放置5min，用枪头吹打。
[0042] 2)将各孔裂解液吸到1. 5mlEP管中，加入氯仿0· 2ml每管，用力振摇15s，室温放 置 3 到 5min，离心（4°C，12000rpm，15min)。
[0043] 3)离心后，液体分为三层（上层为无色水样层，中层白色为DNA，底层红色为蛋白 质）小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。
[0044] 4)加入等体积的异丙醇，0. 4~0. 5ml，上下颠倒混勾，室温放置lOmin离心（4°C， 12000rpm，lOmin)。
[0045] 5)去上清，沉淀加入无水乙醇1ml。漩涡震荡30s，离心（4°C，7500rpm，5min)。
[0046] 6)小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置，干燥3~5min。最好使用枪头吸 取上清，尽量除去。
[0047] 7)加入20 μ 1 DEPC水溶解，分装5 μ 1管中，-8 °C冰箱保存。
[0048] 8)细胞总RNA的鉴定：0. 9~1. 2%琼脂糖鉴定细胞总RNA，观察出现的条带及各 条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值 (0D)，并计算RNA含量和纯度。
[0049] 2，逆转录合成第一链cDNA
[0050] 合成步骤：
[0051] 1)建立20ul的反应体系
[0052] 将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中：
[0053]
[0054] 2)混合物在65°C加热5min后，迅速至于冰上冷却，短暂离心后加入以下组分：
[0055]
[0056] 3)在室温下加入1 μ 1 (200)单位M-MLV逆转录酶，轻轻吹打混匀。
[0057] 4)37°C孵育 50min，70°C加热 15min，-20°C保存。
[0058] 3，使用 Bi〇-RAD IQ? SYBR ?丨 Green Supermix 进行焚光定量 PCR
[0059] 1)将 cDNA 稀释 5 倍：1 μ 1 cDNA+4 μ 1 无菌水
[0060] 配成10 μ 1体系：
[0061]
[0062] 2)上机，eppendorf定时焚光PCR仪
[0063]
[0064] 三 Western blot 筛选
[0065] 1，总蛋白提取
[0066] 1)传代后，待细胞生长到对数生长期，且细胞汇合率达80 %时，进行细胞总蛋白 的提取。吸去培养液，每瓶培养皿细胞用2ml PBS漂洗，重复两次。弃去PBS，将培养皿置于 冰上。
[0067] 2)按1ml裂解液加10 μ 1 PMSF(lOOmM)(细胞裂解液+1%的蛋白酶抑制剂），摇匀 置于冰上。
[0068] 3)每瓶皿细胞加200 μ 1含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解 培养皿要经常来回摇动。
[0069] 4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂 解液移至1. 5ml EP管中。4°C下12000rpm离心5min。
[0070] 5)将离心后的上清液转移到1. 5ml EP管中放于-20°C保存。
[0071] 2,按照BCA试剂盒说明测定蛋白含量计算上样量。
[0072] 1)标准曲线绘制：取一块酶标板，按照表2-1加入试剂
[0073] 表2-1不同蛋白标准液中的蛋白含量
[0074]
[0075] 2)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50 : 1)配制适量 BCA工作液，充分混匀；
[0076] 3)各孔加入200 μ 1 BCA工作液；
[0077] 4)把酶标板放在振荡器上振荡30s，放入37°C的恒温培养箱放置30min，然后在 562nm下比色测定。以蛋白含量（μ g)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
[0078] 5)稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20 μ 1，加入BCA工作液 200 μ 1，充分混匀，37°C放置30分钟后，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记 录吸光值；
[0079] 6)计算相应蛋白的含量：根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的 蛋白含量（yg)，除以样品稀释液总体积（20yl)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度 (单位：μ g/ μ 1)。3, SDS-PAGE 电泳
[0080] 1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
[0081] 2)配10%分离胶，灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带 中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
[0082] 3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒 去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
[0083] 4)配10%的浓缩胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
[0084] 5)将其放入电泳槽中，取出上样样品至1. 5ml离心管中，加入5Xloading buffer 至终浓度为1 X (上样总体积一般不超过30 μ 1，加样孔的最大限度可加40 μ 1样品）。上 样前要将样品于沸水中煮l〇min使蛋白变性。
[0085] 5)加足够的电泳液后开始准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板）。
[0086] 6)电泳时间一般lh，开始时电压为90V较好，等样品跑过浓缩胶将电压调为120V。 电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
[0087] 4,转膜
[0088] 1)准备滤纸和PVDF膜，先浸于甲醇溶液中，后浸于转膜液中才可使用。在加有转 移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
[0089] 2)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡，再垫上三层滤纸。
[0090] 3)要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻。撬一会儿玻璃板便开始松动， 直到撬去玻板。除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮，要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶 盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个 胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹 子，使整个装置呈"三明治"的形状。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
[0091] 4)将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转 移时会产热，在槽的一边放一冰盒来降温，用恒流300mA转1. 5h。
[0092] 5,免疫反应
[0093] 有两条膜，一条是在42kDa上下的称为膜a ;另一条是在88kDa上下的称为膜b。
[0094] 1)将膜a与膜b都移至含有封闭液（5%脱脂牛奶+TBST)的平皿中，室温下脱色 摇床上摇动封闭lh。转移至4°C封闭摇床过夜。
[0095] 2)从4 °C拿出，转入室温，摇床lh。膜a加 β -ActinAntibody (稀释比为 1 : 2000);膜b加一抗（稀释比1 : 250)，室温下孵育2h，用TBST在室温下脱色摇床上洗 三次，每次6min。
[0096] 3)膜a与膜b都加二抗（稀释比1 : 8000)，室温下孵育lh，用TBST在室温下脱 色摇床上洗三次，每次6min。
[0097] 6,曝光
[0098] 将Western Blotting超敏化学发光底物A液、B液各50 μ 1等量混合与1ml水中， 均勾加至膜上反应5min，X光片曝光。
[0099] 7,凝胶图像分析
[0100] 将胶片扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
【主权项】
1. 一种稳定沉默FGFR4基因表达的肝癌细胞株，其特征在于，构建方法分为以下两部 分：l)FGFR4-miRNA的表达载体构建和鉴定；2)沉默效果最佳的miRNA质粒表达载体的筛 选。将沉默效果最佳的miRNA质粒转染到FGFR4高表达肝癌细胞即建立沉默FGFR4基因表 达稳定肝癌细胞株。2. 权利要求1所述的FGFR4基因 miRNA表达质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步 骤：针对人FGFR4基因序列，设计合成3对最佳miRNA的oligo靶序列，分别退火的产物与 线性化干扰载体pcDNA?6. 2-GW/EmGFP进行连接反应，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆，测序 验证。3. 权利要求1所述的沉默效果最佳的miRNA质粒表达载体的筛选，其特征在于，包括 以下步骤：将3个miRNA质粒和阴性对照空质粒转染到FGFR4高表达肝癌细胞，用荧光显 微镜观测各组转染细胞GFP表达情况，再通过实时荧光定量PCR和Western blot检测各组 FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达情况，筛选出对肝癌细胞株FGFR4基因沉默效果最明显的 miRNA靶点。该靶点为ATCTGGAGTCCCGGAAGTGTA，FGFR4高表达肝癌细株为!fepG2细胞。4. 权利要求1所述的沉默FGFR4基因表达稳定肝癌细胞株在抑制FGFR4基因表达方面 的应用。
【文档编号】C12N15/85GK105886473SQ201510041456
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2015年1月26日
【发明人】蔡琳, 陈智心, 高赢政, 李校堃
【申请人】温州医科大学