一种扩增nk细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种扩增NK细胞的方法，该方法使用失活的LCL饲养细胞、外周血单个核细胞、细胞因子IL?2和IL?15在细胞培养液中进行细胞培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增，其中外周血单个核细胞与失活的LCL饲养细胞的配比为0.5～2.5，细胞因子IL?2的浓度为100～500U/L，细胞因子IL?15的浓度为5～50ng/ml。本发明的有益效果是：显著提高了NK细胞的扩增效率，而且提高了NK杀伤功能；通过实验，本发明的方案可以扩增NK细胞达600～800倍，与新鲜分离的NK细胞比较，对白血病细胞K562杀伤能力提高10倍，与单纯的利用IL?2培养后的NK细胞对白血病细胞K562杀伤能力提高20％以上。
【专利说明】
一种扩増NK细胞的方法
技术领域
[00011本发明涉及一种扩增NK细胞的方法。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK cell)是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染 的重要免疫细胞，无需有抗体存在或者预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗 的重要效应细胞。NK细胞对于不同来源的肿瘤细胞都具有很强的杀伤作用，在肿瘤的免疫 细胞治疗方面有着良好的应用和发展前景。在外周血中约占淋巴细胞的5%_10%，所占比 例很少。如何获得足够数量的高杀伤性的NK细胞是NK细胞应用于临床的重要保证。外周血 中分离出来的高纯度的NK细胞数量有限且增殖能力弱，在体外不给予其他影响因素的情况 下，NK细胞增殖的效率和杀伤功能低下。
[0003] 目前国内外有很多体内扩增NK细胞的方法，大致可分为两种，1)NK细胞分离纯化 后利用细胞因子刺激或者联合饲养细胞达到增殖的目的；2)利用外周的单个核细胞联合细 胞因子、饲养细胞选择性的对NK细胞增殖。例如，应用IL-2等细胞因子以及特殊的培养液对 NK细胞进行增殖研究，在增殖效率或者细胞的杀伤功能均有明显不足。其中包括了利用细 胞因子IL-15(Dunne J等，Immunology，vol · 167:3129.2001 ;SA Perez等，Blood，vol · 106: 158,2005)、利用作为刺激CD3的0KT-3抗体（Condiotti R等，Experiment Hematology 29: 104,2001)，以单独或者结合的使用形式来增殖NK细胞的研究。Fujisaki等研究出利用 K562-mbl5-41BBL作为饲养细胞（feeder cell)来增殖NK细胞（Cancer Res 69:4010,2009) 可以达到90.5倍级别的扩增，但是扩增效率相对低下。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是:提供一种扩增NK细胞的方法，提高NK细胞扩增效率。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种扩增NK细胞的方法，使用失活 的LCL饲养细胞、外周血单个核细胞、细胞因子IL-2和IL-15在细胞培养液中进行细胞培养， 对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增，其中外周血单个核细胞与失活的LCL饲养 细胞的配比为〇. 5~2.5，细胞因子IL-2的浓度为100~500U/L，细胞因子IL-15的浓度为5~ 50ng/ml〇
[0006] 进一步限定，具体步骤为:a)原料准备:分别制备失活的LCL饲养细胞和外周血单 个核细胞，并将失活的LCL饲养细胞和外周血单个核细胞通过NK细胞培养液调整至相同的 细胞浓度备用，NK细胞培养液为添加入细胞因子IL-2和IL-15的细胞培养液;b)按照外周血 单个核细胞/失活的LCL饲养细胞为0.5-2.5的比例，将步骤a制备的失活的LCL饲养细胞和 外周血单个核细胞混合并培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增。
[0007] 进一步限定，在步骤b中从最初培养日开始至第5~7天内再次加入通过NK细胞培 养液调整过的失活的LCL饲养细胞，然后根据细胞生长状态在接下来的培养过程中更换NK 细胞培养液。
[0008] 进一步限定，步骤b的培养周期为三周。
[0009] 进一步限定，制备失活的LCL饲养细胞的方法为：
[0010] 1)制备富含EBV病毒的EBV上清液；
[0011 ] 2)制备EBV感染培养液(A)，该EBV感染培养液(A)为包含EBV上清液、抗生素和白介 素-10的细胞培养液，
[0012] 制备EBV感染培养液(B)，该EBV感染培养液(B)为包含抗生素和白介素-10的细胞 培养液；
[0013] 3)在外周血单个核细胞中加入EBV感染培养液(A)进行培养，并根据培养情况补充 或更换EBV感染培养液(B);
[0014] 4)对LCL饲养细胞进行失活处理，得到失活的LCL饲养细胞。
[0015]进一步限定，外周血单个核细胞由外周血通过淋巴细胞分离液分离得到。
[0016]进一步限定，LCL饲养细胞用紫外线照射180~260焦耳进行照射完成失活处理。 [0017] 进一步限定，细胞培养液为10%FBS/RPMI1640。
[0018] 本发明的有益效果是:通过本发明的方法大大提高了 NK细胞的扩增效率，而且可 以改变NK杀伤功能，通过实验，本发明的方案可以扩增NK细胞达600~800倍，与新鲜分离的 NK细胞比较，对白血病细胞K562杀伤能力提高10倍，与单纯的利用IL-2培养后的NK细胞对 白血病细胞K562杀伤能力提高20 %以上。
【附图说明】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
[0020]图1是通过本发明的方法进行培养获得的NK细胞增殖能力的结果；
[0021] 图2是本发明的方法与单纯应用IL-2培养条件下获得NK细胞纯度的比较结果；
[0022] 图3是本发明的方法与新鲜分离得NK细胞对肿瘤细胞杀伤能力的比较结果；
[0023]图4是本发明的方法与单纯IL-2培养获得得NK细胞对肿瘤细胞杀伤能力的比较结 果；
【具体实施方式】
[0024] 一种扩增NK细胞的方法，使用失活的LCL饲养细胞、外周血单个核细胞、细胞因子 IL-2和IL-15在细胞培养液中进行细胞培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩 增，其中外周血单个核细胞与失活的LCL饲养细胞的配比为0.5~2.5，优选0.5，细胞因子 IL-2的浓度为100~500U/L，优选100U/L，细胞因子IL-15的浓度为5~50ng/ml，优选5ng/ ml 〇
[0025]该扩增NK细胞的方法具体步骤为：
[0026] a)原料准备：
[0027]分别制备失活的LCL饲养细胞和外周血单个核细胞，并将失活的LCL饲养细胞和外 周血单个核细胞通过NK细胞培养液调整至相同的细胞浓度备用，
[0028] NK细胞培养液为添加入细胞因子IL-2和IL-15的细胞培养液，细胞因子IL-2的浓 度为100~500U/L，优选100U/L，细胞因子IL-15的浓度为5~50ng/ml，优选5ng/ml;
[0029]制备失活的LCL饲养细胞的方法为：
[0030] 1)制备富含EBV病毒的EBV上清液；
[0031] 2)制备EBV感染培养液(A)，该EBV感染培养液(A)为包含EBV上清液、抗生素和白介 素-10的细胞培养液，
[0032]制备EBV感染培养液(B)，该EBV感染培养液(B)为包含抗生素和白介素 -10的细胞 培养液；
[0033] 3)在外周血单个核细胞中加入EBV感染培养液(A)进行培养18小时，再补充EBV感 染培养液(B)，每周更换EBV感染培养液(B)，得到LCL饲养细胞；
[0034] 4)对LCL饲养细胞用紫外线照射180~260焦耳进行照射完成失活处理，得到失活 的LCL饲养细胞。
[0035] b)按照外周血单个核细胞/失活的LCL饲养细胞为0.5-2.5的比例，该比例为细胞 个数比，优选0.5,将步骤a制备的失活的LCL饲养细胞和外周血单个核细胞混合并培养，对 外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增。
[0036]在步骤b中从最初培养日开始至第5~7天内再次加入通过NK细胞培养液调整过的 失活的LCL饲养细胞，然后根据细胞生长状态在接下来的培养过程中更换NK细胞培养液。 [0037]步骤b的培养周期为三周。
[0038]该扩增NK细胞的方法中，外周血单个核细胞由外周血通过淋巴细胞分离液分离得 至丨J。细胞培养液为1 〇 % FBS/RPMI1640。
[0039] 以下述具体实施例，对本发明进一步说明：
[0040] 制备失活的LCL饲养细胞液的步骤如下：
[00411 1、制备富含EBV病毒的EBV上清液:将l*10e6B95-8细胞放于6孔培养板中，加入5ml 10 %FBS/RPMI-1640培养液培养72小时，然后以1500rpm离心10分钟，收集上清液，用0.22针 头过滤器过滤上清液，分装并储存于-80°C低温冰箱备用。
[0042] 2、制备EBV感染培养液(A):
[0043] 每10ml EBV感染培养液(A)中包含： 胎牛血清 1.5 ml EBV上清液 2 ml
[0044] 环孢素 _A 20 ug ? 介素-10 100 ng 余 ijiU 丨1640。
[0045] 制备EBV感染培养液(B):
[0046] 每10ml EBV感染培养液(B)中包含：
[0047] 胎牛血清 1.5ml
[0048] 环孢素 A 20ug
[0049] 白介素 -10 100ng
[0050] 余量为 PRMI 1640。
[00511 3、取健康人的外周血10ml，将采集的5ml血放入15ml的离心管中，在血液中追加 5ml PBS稀释，用洗液管搅拌均匀。在新的15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，在装有淋 巴细胞分离液的离心管上小心的加入上述经过稀释的血液，然后以3000rpm的转速在常温 下离心20分钟。
[0052] 4、小心的取出淋巴细胞分离液和血浆之间形成的白色的细胞层并移至新的15ml 离心管，添加 PBS缓冲液至15ml，将细胞混合后以1500rpm的转速进行离心10分钟。
[0053] 5、去掉上层的离心液，再次加入PBS缓冲液至10ml，用吸管吹打悬浮细胞，然后再 常温下以1500rpm离心10分钟，重复两次。
[0054] 6、将步骤5收集得到的单个核细胞用lmlEBV感染培养液(A)悬浮，将10ul上述细胞 溶液移至500ul的微管，加入10ul台盼蓝(Gibco)后用洗液管混合均匀，取10ul滴入细胞计 数板，利用倒置显微镜观察计数。
[0055] 7、取l*10e6/ml步骤5收集得到的单个核细胞加入24孔培养板中，加入步骤2制备 的富含EBV感染培养液(A)至2毫升，放在37°C、5%C02培养条件下培养18小时后，小心吸除 1.5毫升上清后再补充1.5毫升EBV感染培养液(B)后继续培养。每周换液一次，去除50%细 胞上清，加入等量EBV感染培养液(B)，得到所需要的LCL滋养细胞。第7周后加入的EBV感染 培养液(B)中可以不再添加环孢素 A，
[0056] 8、将得到LCL饲养细胞用紫外线照射180~260焦耳完成失活处理。用NK细胞培养 液调整细胞浓度到l*l〇e6细胞/ml。
[0057] NK细胞的培养步骤如下：
[0058] 1、取健康人的外周血10ml，将采集的5ml血放入15ml的离心管中，在血液中追加 5ml PBS缓冲液稀释，用洗液管搅拌均匀。在新的15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，在 装有淋巴细胞分离液的离心管上小心的加入上述经过稀释的血液，然后以3000rpm的转速 在常温下离心20分钟。
[0059] 2、小心的取出淋巴细胞分离液和血浆之间形成的白色的细胞层并移至新的15ml 离心管，添加 PBS缓冲液至15ml，将细胞混合后以1500rpm的转速进行离心10分钟。
[0060] 3、去掉上层的离心液，再次加入PBS缓冲液至10ml，用吸管吹打悬浮细胞，然后再 常温下以1500rpm离心10分钟，重复两次，得到外周血单个核细胞。
[0061] 4、用lmlNK细胞培养液悬浮，用台盼蓝染色计数，将外周血单个核细胞调整到1* 10e6 细胞/ml。
[0062] 5、对步骤4的外周血单个核细胞液中NK细胞的比例以及免疫表型分析，用于与培 养后的NK细胞进行比较。
[0063] 6、按照外周血单个核细胞液/失活的LCL饲养细胞液为2:1比例进行混合，将混合 液分配到24孔培养板中，加入NK细胞培养液到2毫升/孔，在37 °C、5 % C02培养条件培养三天 后半量更换培养液，培养液为NK细胞培养液。
[0064] 7、从培养日开始算起，到第七天再次加入失活的LCL饲养细胞(与单个核细胞比为 0.5 )，在37 °C、5 % C02培养条件下培养，每三天半量更换培养液，培养液为NK细胞培养液。 [0065] 8、根据细胞增殖情况半量更换NK细胞培养液，培养至约三周，实现NK细胞的扩增 培养。
[0066] 9、对通过扩增培养获得的NK细胞的纯度以及免疫表型分析。
[0067] NK细胞的扩增效率具体方法：
[0068]培养前以及不同培养时间每孔内的细胞，将10ul培养孔里细胞溶液移至500ul的 微管，加入l〇ul台盼蓝(Gibco)后用洗液管混合均匀，取10ul滴入细胞计数板，利用倒置显 微镜观察计数，计算出每孔细胞的浓度，然后乘以每孔的细胞悬液的体积计算出每孔内的 细胞数。如图1可见通过本方法可以显著提高NK细胞培养效率。
[0069] 对通过扩增培养获得的NK细胞的纯度以及免疫表型分析的具体方法如下：
[0070] 收集培养前和培养后外周血单个核细胞液中的NK细胞，细胞计数后用FACS缓冲液 (规格为2.5%PBS/PBS)稀释后至2*10e6/ml，分装到FACS试管（品牌为Falcon，规格为 100u 1 /管）中，按照下述内容加入抗体。
[0071] 1、试管 1:加入抗鼠-IgG-PE/FITC/APC
[0072] 2、试管2:抗人CD16-FITC((BD Pharmingen，）
[0073] 3、试管3:抗人CD56_PE(BD Pharmingen，）
[0074] 4、试管4:抗人CD3_APC(BD Pharmingen，）
[0075] 5、试管5:抗人_CD3_APC(BD Pharmingen,)+抗人CD56_PE(BD Pharmingen，）+抗人 CD16-FITC)
[0076] 将上述各试管放在4°C避光染色30分钟后，染色后在细胞中加入2ml PBS缓冲液， 以1500rpm的转速进行5分钟离心分离。去除上层液后重复上述洗涤一次，再次去除上层液 后加入500ul的roS缓冲液，用加样枪吹打悬浮细胞，利用BD公司的BD FACScantoII流式细 胞仪对细胞的免疫表型进行分析。
[0077] 通过上述该NK细胞的纯度以及免疫表型分析方法，将培养前的新鲜分离得NK细胞 与本发明获得的NK细胞、单纯IL-2培养获得的NK细胞进行纯度以及免疫表型分析，分析结 构如图2所示，可见本发明的方法大大提高了 NK细胞的纯度。
[0078]为证明通过本发明对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性的扩增后得到的NK细 胞的杀伤能力大大提高，本发明通过下述步骤对NK细胞的杀伤能力进行评价，评价步骤为： [0079] 1、制备效应细胞;利用磁珠分离纯化外周血中的NK细胞得到新鲜分离的NK细胞、 单纯IL-2培养扩增的NK细胞以及本发明方法培养扩增的NK细胞 [0080] 2、制备靶细胞;利用白血病细胞株K562作为靶细胞。
[0081 ] 3、杀伤能力测试：
[0082]把革巴细胞(K562)预选用0 · lumol/L Calcein acetoxymethyl ester(CAM)孵育 15 分钟后，标定的靶细胞用PBS缓冲液洗两次，然后用培养液重新调整细胞浓度，并按照5 X 1〇5/孔放到圆底的96孔培养板中，然后根据不同的E:T比值加入效应细胞，在培养箱里一起 孵育10个小时后用PBS缓冲液洗一次，然后用结合缓冲液重新混悬细胞，然后用加入7-AAD 抗体在常温中孵育15分钟后用流式细胞仪检测特异性杀伤。特异性杀伤用百分比用公 式：％ (特异性杀伤）=(CT-TE/CT) X 100% (CT表示在对照孔中活细胞的所占的比率;TE表 示测试管中活细胞所占的比率）。
[0083]通过该NK细胞的杀伤能力评价步骤，将本发明获得的NK细胞与新鲜分离得NK细胞 对肿瘤细胞杀伤能力进行比较，比较结果如图3所示
[0084]将本发明获得的NK细胞与单纯IL-2培养获得的NK细胞对肿瘤细胞杀伤能力进行 比较，比较结果如图4所示。
【主权项】
1. 一种扩增NK细胞的方法，其特征是:使用失活的LCL饲养细胞、外周血单个核细胞、细 胞因子IL-2和IL-15在细胞培养液中进行细胞培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择 性的扩增， 其中外周血单个核细胞与失活的LCL饲养细胞的配比为0.5~2.5， 细胞因子IL-2的浓度为100~500U/L， 细胞因子IL-15的浓度为5~50ng/ml。2. 根据权利要求1所述的扩增NK细胞的方法，其特征是:具体步骤为： a) 原料准备： 分别制备失活的LCL饲养细胞和外周血单个核细胞，并将失活的LCL饲养细胞和外周血 单个核细胞通过NK细胞培养液调整至相同的细胞浓度备用， NK细胞培养液为添加入细胞因子IL-2和IL-15的细胞培养液； b) 按照外周血单个核细胞/失活的LCL饲养细胞为0.5-2.5的比例，将步骤a制备的失活 的LCL饲养细胞和外周血单个核细胞混合并培养，对外周血单个核细胞中的NK细胞选择性 的扩增。3. 根据权利要求2所述的扩增NK细胞的方法，其特征是:在步骤b中从最初培养日开始 至第5~7天内再次加入通过NK细胞培养液调整过的失活的LCL饲养细胞，然后根据细胞生 长状态在接下来的培养过程中更换NK细胞培养液。4. 根据权利要求2或3所述的扩增NK细胞的方法，其特征是:步骤b的培养周期为三周。5. 根据权利要求1或2所述的扩增NK细胞的方法，其特征是:制备失活的LCL饲养细胞的 方法为： 1) 制备富含EBV病毒的EBV上清液； 2) 制备EBV感染培养液(A)，该EBV感染培养液(A)为包含EBV上清液、抗生素和白介素-10的细胞培养液， 制备EBV感染培养液(B)，该EBV感染培养液(B)为包含抗生素和白介素-10的细胞培养 液； 3) 在外周血单个核细胞中加入EBV感染培养液(A)进行培养，并根据培养情况补充或更 换EBV感染培养液(B); 4) 对LCL饲养细胞进行失活处理，得到失活的LCL饲养细胞。6. 根据权利要求1或2或5所述的扩增NK细胞的方法，其特征是:所述的外周血单个核细 胞由外周血通过淋巴细胞分离液分离得到。7. 根据权利要求1或2或5所述的扩增NK细胞的方法，其特征是:所述的LCL饲养细胞用 紫外线照射180~260焦耳进行照射完成失活处理。8. 根据权利要求1或2或5所述的扩增NK细胞的方法，其特征是：所述的细胞培养液为 10%FBS/RPMI1640〇
【文档编号】C12N5/0783GK105886470SQ201610482853
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】卢绪章, 陆肇阳, 沈健
【申请人】江苏蒙彼利生物科技有限公司