用于增强病毒效力的组合物和方法

用于增强病毒效力的组合物和方法
【专利摘要】提供了病毒敏化化合物，所述化合物通过增加病毒在细胞中的扩散、增加细胞中病毒的滴度或增加病毒对细胞的细胞毒性来增强病毒的效力。还提供了使用所述化合物的其他用途、组合物和方法。
【专利说明】用于増强病毒效力的组合物和方法
[00011本申请是申请号为201080036267.6、发明名称为"用于增强病毒效力的组合物和 方法"的申请的分案申请，该母案申请是2010年7月7日提交的PCT申请PCT/CA2010/001057 进入中国国家阶段的申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及增强病毒生长、扩散或细胞毒性的化合物。更具体地说，本发明涉及增 强溶瘤病毒效力的化合物和使用所述化合物的方法。
【背景技术】
[0003] 溶瘤病毒（oncolytic viruses，0V)是新颖的复制治疗剂（replication therapeutics)，选择或设计所述病毒使其优先在癌细胞中生长并杀伤所述癌细胞。多样的 0V平台已显示出治疗多种类型癌的前景（1~5)。由于0V的自我复制特性，0V治疗的主要挑 战不是所有肿瘤的初始饱和，而是当其感染了合理量的癌组织之后，在肿瘤细胞内有效的 扩散。与多数活疫苗非常类似的是，几乎所有0V都经过遗传修饰或选择以减弱生长。这限制 了 0V在正常宿主组织中的扩散，然而也可能减弱其在肿瘤中和肿瘤之间迅速扩散的天然能 力(6)。
[0004] 水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)是在多种体内癌模型中显 示出杰出效力的0V(2，3，7)。VSV是小的、有包膜的、负链RNA弹状病毒，其对I型干扰素 (interferon，IFN)特别敏感，所述I型干扰素是正常的先天细胞抗病毒免疫的关键组成部 分。在多数癌中，IFN应答通路是有缺陷的，且VSV可以是极其有效的（2，3)。然而，多种癌保 持强大的抗病毒防御，导致单独使用时VSV的有效性低得多(5,8)。
[0005] 我们以前已经证明组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor， HDI)增强VSV感染和杀伤耐受性肿瘤细胞的能力，部分原因是HDI所诱导的对IFN介导的抗 病毒应答的抑制（9)以及对凋亡作用的增强（10)。在小鼠中施用VSV之前和之后连续施用 HDI导致病毒(优先在肿瘤内）更好的扩散，并且与各自的单独治疗相比，联合治疗导致肿瘤 生长的降低。因为连续施用HDI可导致多种毒性(包括人类中的心脏毒性），人们希望鉴定可 用于增强0V效力的其他小分子。
[0006] 本领域中有鉴定增强病毒生长、扩散或毒性之化合物和组合物的需要。本领域中 还有鉴定增强溶瘤病毒效力之化合物和组合物的需要。此外，本领域中有鉴定用于体外和 体内治疗癌细胞之新方法的需要。
[0007] 发明简述
[0008] 本发明涉及增强病毒生长、扩散或细胞毒性的化合物。更具体地说，本发明涉及增 强溶瘤病毒效力的化合物和使用所述化合物的方法。
[0009] 根据本发明，提供下式的化合物
[0011] 其N-氧化物、药学上可接受的加成盐、季胺或立体化学异构体形式，其中：
[0012] A是包含1~4个杂原子和1或2个双键的5元杂环，所述杂原子选自0、N或S;
[0013] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0014] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0015] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基，和
[0016] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0017]根据另一个实施方案，提供上文中描述的化合物，其中A为
[0019] 父:是~順或S;
[0020] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0021 ] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0022] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基，和
[0023] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0024] 本发明还提供上文中描述的化合物，其表示为
[0026] 其中，
[0027] 父丨是^順或S;
[0028] 乂2、乂3和乂4独立地是(：或1
[0029] X5是C;
[0030] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0031 ] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0032] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基；
[0033] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基；
[0034] 其中原子X2和X3之间的键是单键或双键；
[0035] 其中原子Χ3和Χ4之间的键是单键或双键；
[0036] 其中原子Χ4和Χ5之间的键是单键或双键；
[0037]其中原子Χ5和X!之间的键是单键或双键；
[0038] 其中当原子X2和X3之间的键与X4和X5之间的键各自是单键时，原子X 3和X4之间的键 是双键，原子Χ5和Xi之间的键是单键，χ2是C，并且R1是氧代;或者
[0039] 其中当原子Χ2和Χ3之间的键与Χ4和Χ 5之间的键各自是单键时，原子Χ3和Χ4之间的键 是双键，原子Χ5和乂:之间的键是双键，并且乂:是?^，或者
[0040] 其中当原子X2和X3之间的键与Χ4和X 5之间的键各自是双键时，原子X3和X4之间的键 是单键，并且Χ5和X!之间的键是单键。
[0041] 在另一个实施方案中，提供上文中描述的化合物，其表示为
[0043] 其中：
[0044] 父1是〇、順或5;
[0045] R2是烷基、卤素、羧基或羟基；
[0046] R3是烷基或卤素，和
[0047] R4是烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0048] 还提供了上文中描述的化合物，所述化合物选自：3,4_二氯-5-苯基_2,5_二氢呋 喃-2-酮、2-苯基-1H-咪唑-4-羧酸1.5水合物、3-[5-(2,3_二氯苯基)-2Η-1，2,3,4-四唑-2-基]丙酰肼、3，5-二甲基-4- {[(2-氧代-3-氮杂环庚烷基)氨基]磺酰基} 1H-吡咯-2-羧酸 乙酯、2-氨基-5-苯基-3-噻吩羧酸、3-[(喹啉-6-基羰基)氨基]噻吩-2-羧酸甲酯、5-( 2-氯-6-氟苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮和5-( 2，6-二氯苯基)-3-羟基-4-甲基-2， 5_二氢呋喃-2-酮。
[0049] 本发明还提供具有下式的化合物
[0051] 其中，
[0052] X是 0或 S;
[0053] R5是羟基烷基、杂芳基、未取代的芳基、以1或多个选自烷基和卤素的取代基取代 的芳基、杂环基或苯并二氧杂环烷基烷基(benzodioxylalkyl);和
[0054] R6是氨基、芳基或以1或多个选自烷基和卤素的取代基取代的芳基。
[0055]还提供了上文中描述的化合物，其中所述化合物选自N-(3,4_二甲基苯基） (2-吡啶基)硫脈、Nl_(2，6-二乙基苯基)餅-1-硫代甲酰胺、N_(2-轻乙基_(2_甲基苯 基)硫脲、Nl-(2-氯-6-甲基苯基)肼-1-硫代甲酰胺和N-(4-氯苯基)1-(2,3-二氢-1，4-苯 并二氧杂环己_2_基甲基）脈（N-(4_chlorophenyl )-N' - (2，3-dihydr〇-l，4_benzodioxin-2_ylmethyl)urea)〇
[0056] 本发明还提供上文中描述的化合物，所述化合物选自：3，4-二氯-5-苯基-2，5-二 氢呋喃-2-酮、2-苯基-1H-咪唑-4-羧酸1.5水合物、3-[5-(2,3_二氯苯基)-2Η-1，2,3,4-四 唑-2-基]丙酰肼、3，5-二甲基-4- {[(2-氧代-3-氮杂环庚烷基)氨基]磺酰基} 1H-吡咯-2-羧 酸乙酯、2-氨基-5-苯基-3-噻吩羧酸、3-[(喹啉-6-基羰基)氨基]噻吩-2-羧酸甲酯、5-( 2-氯-6-氟苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮和5-( 2，6-二氯苯基)-3-羟基-4-甲基-2,5_二氢呋喃-2-酮、N-(3,4-二甲基苯基)-1/-(2-吡啶基)硫脲、Nl-(2,6-二乙基苯基)肼-1-硫代甲酰胺、N-(2-羟乙基)-N~(2-甲基苯基)硫脲、Nl-(2-氯-6-甲基苯基)肼-1-硫代甲 酰胺、N-(4-氯苯基)-N /-(2,3-二氢-l，4-苯并二氧杂环己-2-基甲基)脲、4-(苄氧基)-2-甲基-1-硝基苯、l-{4-[(2-甲基喹啉-4-基)氨基]苯基}乙-1-酮、Nl-(l，2,3，10-四甲氧基-9_氧代_5,6,7,9_四氢苯并[a]庚搭烯-7-基）乙酰胺、N-[4-(二甲基氨基)亚苄基]氨基甲腙 酉爱硫甲酯（methyl N-[4-(dimethylamino)benzylidene] aminomethanehydrazonothioate)、N-(4_氯苯基）-(二甲基氨基）甲酰亚胺硫甲酯氢碘酸盐 (methyl N-(4-chlorophenyl)-(dimethylamino)methanimidothioate hydroiodide)、4/ ， 5'-二氢-(5-甲氧基苯基)螺[2H-1-苯并噻喃-3(411)11^ _[3H]吡唑]-4-酮、1H-苯并[d] 咪唑-2-硫醇、N-(2-呋喃基亚甲基)-(4-{[(2_呋喃基亚甲基)氨基]甲基}环己基）甲胺;2-[4_(二乙氧基甲基)亚苄基]丙二臆;2_(环丙基幾基)-3-(3-苯氧基_2_噻吩基)丙稀臆;-(3，5-二氯苯基）_2，4-二氣苯甲酰餅；1〇-(羟基亚甲基）菲-9( 10H)-酮;Nl_(2，5-二氣苯 基)-4-({[ 4-(三氟甲基)苯基]磺酰基}氨基)苯-1 -磺酰胺;N- [ 4- (4-氯苯基)-2，5-二氧代 哌嗪基]-2-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基）乙酰胺、4-{[(4-{[(3_羧基丙烯酰基)氨基]甲基}环 己基）甲基]氨基}_4_氧代-2-丁烯酸；5-氧代-3-苯基-5-{4-[3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-1-基]苯胺基}戊酸、Nl-(4-氯苯基)-2-({4-甲基-5-[l-甲基-2-(甲基硫代)-lH-咪唑-5-基]-4H-l，2,4-三唑-3-基}硫代）乙酰胺、6-[2-(4-甲基苯基)-2-氧代乙基]-3-苯基-2,5-二氢-1，2,4_三嗪-5-酮;Nl-[2-(叔丁基)-7-甲基-5-(三氟甲基)吡唑并[l，5-a]嘧啶-3-基]乙酰 胺;4-(2,3_二氢-1H-茚-5-基)-6-(三氟甲基）嘧啶-2-胺；1-(2,3_二氢-1-苯并呋喃-5-基 磺酰基)-4-哌啶羧酸乙酯、2,3-二苯基环丙-2-烯-1-酮、1-环十二烷基-1H-吡咯-2，5_二 酮、1-(4-甲基苯基)-2,5_二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、2-[(4-苯氧基苯胺基）甲基]异二氢吲 哚-1，3-二酮、2-{[1-(3_氯-4-甲基苯基)-2,5_二氧代四氢-1H-吡咯-3-基]硫代}苯甲酸、 1-( 1，3-苯并二氧杂环戊-5-基甲基)-2，5-二氢-1H-吡咯-2，5-二酮、4-氯-N-[3-氯-2-(异 丙基硫代)苯基]苯甲酰胺和N- ({5- [({2- [(2-呋喃基甲基)硫代]乙基}氨基)磺酰基]-2-噻 吩基}甲基)苯甲酰胺。在一个优选的实施方案中，所述化合物是3,4_二氯-5-苯基_2,5_二 氢咲喃-2-酮（3，4-dichlor〇-5-pheny 1-2，5-dihydrofuran-2-〇ne，DCPDF) 〇
[0057] 本发明还提供包含上文中描述的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂 的组合物。
[0058]此外，本发明提供组合物，所述组合物包含上文中描述的化合物和以下的一种或 更多种:a)病毒，优选减毒的病毒、遗传修饰的病毒或溶瘤病毒;b) -种或更多种癌细胞;c) 载体、稀释剂或赋形剂;d)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂;e)非癌细胞;f)细胞培养 基;g)-种或更多种癌治疗剂;或a)~g)的任何组合。
[0059] 在一个不是意在以任何方式进行限制的具体实施方案中，提供了上文中描述的化 合物和用于生长、培养或以病毒感染细胞的培养基，和任选地一种或更多种能够被所述病 毒感染的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是永生化的细胞、癌细胞或肿瘤细胞。在一 个替代的实施方案中，所述细胞是MDCK、HEK293、Vero、HeLa或PER.C6细胞。
[0060] 还提供了试剂盒，所述试剂盒包含上文中描述的化合物和a)病毒，优选减毒的或 遗传修饰的病毒或溶瘤病毒;b) -种或更多种癌细胞;c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋 形剂;d)非癌细胞;e)细胞培养基;f) 一种或更多种癌治疗剂，g)细胞培养板或多孔皿;h)向 细胞、培养基或对象递送病毒敏化化合物(viral sensitizing compound)的设备；i)使用 所述病毒敏化剂的说明书;j)载体稀释剂或赋形剂，或a)~j)的任何组合。
[0061] 在一个不是意在以任何方式进行限制的具体实施方案中，提供了试剂盒，所述试 剂盒包含上文中描述的化合物和用于生长、培养或以病毒感染细胞的培养基，和任选地一 种或更多种能够被所述病毒感染的细胞。所述试剂盒还包含使用本文中描述的任何组分或 组分之组合和/或进行本文中描述的任何方法的使用说明。
[0062] 本发明还提供了增强病毒在细胞中扩散的方法，所述方法包括在所述病毒之前、 之后或同时将本文中描述的化合物施用至细胞。所述方法优选在体外进行。
[0063] 本发明还提供增强减毒的病毒或遗传修饰的病毒在细胞中扩散的方法，所述方法 包括在所述减毒的或遗传修饰的病毒之前、之后或同时将本文中描述的化合物施用至细 胞。
[0064] 本发明还提供增强溶瘤病毒在肿瘤或癌细胞中扩散的方法，所述方法包括在所述 溶瘤病毒之前、之后或同时将上文中描述的化合物施用至癌或肿瘤细胞。所述癌或肿瘤细 胞可为体内或体外，优选来自哺乳动物对象体内，所述对象例如但不限于人类对象。
[0065] 还提供了增加溶瘤病毒在癌或肿瘤细胞中溶瘤活性的方法，所述方法包括在所述 溶瘤病毒之前、之后或同时将上文中描述的化合物施用至癌或肿瘤细胞。所述癌或肿瘤细 胞可为体内或体外，优选来自哺乳动物对象，所述对象例如但不限于人类对象。
[0066] 本发明还构想通过在上文中描述的化合物存在的条件下，使病毒在适宜的培养 基中生长而生产病毒的方法。
[0067] 本发明还构想通过在上文中描述的化合物存在的条件下，使病毒在适宜的培养基 中生长而生产减毒的病毒的方法。
[0068] 本发明还构想通过在上文中描述的化合物存在的条件下，使病毒在适宜的培养基 中生长而生产遗传修饰的病毒的方法。
[0069] 本发明还构想通过在上文中描述的化合物存在的条件下，使病毒在适宜的培养基 中生长而生产溶瘤病毒的方法。
[0070] 本发明的这一简述并不必然描述本发明的所有特征。
【附图说明】
[0071] 通过以下参照附图的说明，本发明的这些特征和其他特征将会变得更加明显，其 中：
[0072] 图1显示3,4二氯-5-苯基_2,5_二氢呋喃酮(DCPDF)对VSVA51在CT26结肠癌细胞 中扩散之作用的结果。以多种剂量的DCPDF预孵育CT26细胞4小时，并随后用感染复数 (multiplicity of infection，MOI)为0.03的表达RFP的VSVA 51 攻击所述细胞。感染后42 小时拍摄荧光照片。
[0073]图2显示DCPDF对VSVA51在4T1乳腺癌细胞中扩散之作用的结果。以多种剂量的 DCPDF预孵育4T1细胞4小时，并随后用感染复数为0.01或0.001的表达RFP的VSV Δ 51攻击所 述细胞。感染后42小时拍摄荧光照片。还以5μΜ使用SAHA作为阳性对照。
[0074]图3显示DCTOF对VSVA 51在4T1乳腺癌细胞中所诱导的细胞毒之作用的结果。以多 种剂量的DCPDF预孵育4T1乳腺癌细胞4小时，并随后用Μ0Ι为0.01或0.001的VSV Δ 51攻击所 述细胞。孵育48小时之后，将培养板用考马斯蓝染色。还以5μΜ使用SAHA作为阳性对照。 [0075] 图4显示DCPDF增强从CT26细胞输出VSV的结果。以增加的浓度添加 DCPDF之后4小 时，以0.03的Μ0Ι感染CT26细胞。48小时之后，收集上清液，并用Vero细胞测定滴度。Y轴表示 蚀斑形成单位(plaque forming unit)/ml(PFU/mL)，并且是对数标度。在最高DCPDF浓度 时，VSV滴度以接近31og(1000倍)增加。
[0076] 图5显示3,4二氯-5-苯基_2,5_二氢呋喃酮(DCPDF)对VSV在多种细胞系中之扩散 的作用。a)用DCPDF(以指定的浓度)预处理汇合的细胞4小时，随后以低Μ0Ι (786-0和GM38为 0.03，4T1和CT26和U251为0.01)，用表达RFP的VSV攻击所述细胞。除了正常的GM38细胞之 外，在所有癌细胞系中，VSV的扩散增强。b)显示3,4二氯-5-苯基_2,5_二氢呋喃酮(DCPDF) 在多种癌细胞系(而非在正常细胞中）增加 VSV滴度之作用的结果。用DCPDF(以指定浓度)预 处理汇合的细胞4小时，随后以低ΜΟΙ (786-0、4Τ1和CT26为0.01，GM38为0.03)用表达RFP的 VSV攻击所述细胞。孵育48小时之后，收集上清液，并用Vero细胞测定滴度。要注意的是，在 癌细胞系中（而非在正常的GM38细胞系中），VSV的扩散增强。c)显示的结果表明DCTOF的作 用是剂量依赖性的。使用增加浓度的DCPDF处理细胞。以指定的Μ0Ι用VSV感染后48小时，收 集上清液。
[0077]图6显示表明VSV和DCPDF诱导体外协同杀伤细胞的结果。a)用系列稀释的固定比 例的VSVA51和VSel联合混合物（500PFU:lyM VSVA 51:VSel)处理4T1和CT-26细胞。48小时 之后，使用阿尔玛蓝(alamar blue)试剂评价细胞毒性。根据Chou和Talalay的方法，使用 Calcusyn计算联合指数(combination index，CI)。图表表示受影响细胞的分数(fraction of cells affected，Fa)之函数，CI的代数估计值。误差条表示估计的标准误。b)用增加剂 量的DCPDF预处理4小时之后，用Μ0Ι为0.01的VSV Δ 51或无病毒来攻击汇合的4T1细胞。48小 时之后，固定细胞，并用考马斯蓝染色。
[0078]图7显示表明DCPDF增强溶瘤痘苗病毒之扩散的结果a)以VSel 20μΜ预处理鼠4T1 乳腺癌和B16-F10黑色素瘤细胞4小时，随后用表达荧光cherry蛋白的溶瘤痘苗病毒(VVdd) 攻击所述细胞。感染后72小时拍摄荧光照片。b)随后收集细胞和上清液，并通过标准的蚀斑 测定法(plaque assay)在U20S细胞上测定滴度。
[0079] 图8显示DCTOF处理导致细胞周期分布改变和G1阻断的结果。a)用DCTOF或HDAC抑 制剂TSA处理B16黑色素瘤细胞48小时。随后固定细胞，使用碘化丙啶染色，并通过流式细胞 术分析。使用modfit进行细胞周期分析。b)根据a)中所示的数据，在细胞周期的每个期的细 胞百分比。Ap =凋亡的（apoptotic)。
[0080]图9显示DCTOF可克服预先存在的IFN介导的抗病毒状态的结果。用100U的IFN预处 理人U251细胞24小时。随后，用DCH)F或载剂预处理细胞，然后用VSV △ 51攻击所述细胞48 小时。随后固定细胞并用考马斯蓝染色。
[0081]图10a~j)显示用所选择的药物预处理4T1细胞2小时的结果，所述药物是从超过 13500个化合物的筛选中鉴定的。随后以指定的Μ0Ι (0.03至0.003)，用表达RFP的VSV Δ 51攻 击细胞。48小时之后，拍摄荧光照片，并进行考马斯染色。
[0082]图11显示通过高通量筛选鉴定的多种其他病毒敏化剂候选物和由此获得的结果。 a) 散点图表示其他的高通量筛选数据。y轴对应于参数Log(VSV/对照），其定义为VSV存在下 化合物之细胞毒性与VSV不存在下化合物之细胞毒性之比的对数。对于每种化合物，对重复 测定的平均值进行作图。X轴代表12280个受试化合物的每一个。表现出Log(VSV/对照)值高 于0.3的化合物被认为是潜在的病毒敏化剂（阴影区)b)以96孔板的形式重新测试所鉴定的 潜在病毒敏化剂对4T1细胞的VSVA51增强活性，其中使用ΙΟμΜ浓度的药物和Μ0Ι为0.03的 VSV Δ 51。使用荧光显微镜，用表达RFP的VSV Δ 51毒株来使24小时后的病毒扩散可视化。使 用SAHA(lOyM)作为阳性对照。c)孵育48小时之后收集自b)的上清液的病毒滴度相对于载剂 处理之对照的改变倍数。箭头指示的插图显示VSel的分子结构(3,4_二氯-5-苯基_2,5_二 氢呋喃-2-酮或DCPDF)。所测试的以VSe命名的化合物的具体身份可从本文中的表2中获得。 [0083]图12显示VSel增强VSVA 51扩散并在耐受性细胞中导致协同杀伤细胞的结果。a) 通过蚀斑测定法，用Vero细胞测定收集以载剂对照、20或40μΜ VSel处理4T1、CT26和786-0 细胞的自感染(VSV Δ 51，Μ0Ι为0.01)之后40小时的上清液的VSV Δ 51滴度。数据表示三至四 次独立实验的平均值 *Ρ = 0·007，**ρ = 0·04，#ρ = 0·02，##ρ = 0·01，$ρ = 0·07，$$ρ = 0·05 (AN0VA)。误差条表示标准误。b)用VSel 20μΜ或载剂对照处理CT26细胞，随后用野生型VSV (Μ0Ι = 0.0003)攻击所述细胞。通过蚀斑测定法，用Vero细胞测定感染后18、28和36小时收 集的上清液的病毒滴度。c)显示多种剂量的DCTOF增强来自786-0和CT26细胞的病毒滴度的 结果。
[0084]图13显示a)以ISRE-萤光素酶报道基因和β-半乳糖苷酶(对照)共转染293T细胞的 结果。转染之后6小时，用指定浓度的VSel或载剂处理细胞。接受VSel之后20小时，更换培养 基，并用IFN-α处理细胞。次日，裂解细胞并测量萤光素酶活性。还测量了β-半乳糖苷酶活性 并用于数据标化。*Ρ = 0·03，**ρ = 0·005，***ρ = 0·03，#ρ = 0·003，##ρ = 0·006，###ρ = 0.002Β)用200U/ml Intron Α和VSel(或载剂)共处理人U251神经胶质瘤细胞，随后以0.01 的Μ0Ι用表达GFP的VSV Δ 51攻击所述细胞的结果。40小时之后，收集上清液，并通过蚀斑测 定法，用 Vero 细胞测定滴度。*p = 6.4X10-3，**p = 1.6X10-4，***p = 6.8X10-5(AN0VA)误差 条表示标准误，n = 3。
[0085] 图14显示VSel抑制VSVA51诱导之基因的结果。用SAHA 5yM、VSel 20μΜ或载剂预 处理CT26细胞4小时，随后以0.03的Μ0Ι用VSV Δ 51 (或模拟处理)攻击所述细胞。感染后24小 时，收获细胞并提取RNA。随后，处理RNA用于在Affymetrix小鼠基因1.0ST阵列(Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST)上杂交。将基因表达标化至获自载剂处理的模拟感染对照的值。在a~ b) 中，沿X轴的点表示，通过VSV △ 51感染，每种基因增加超过2倍，并且显示为?。在a)中，在 VSel 20μΜ存在下，VSVA51诱导的基因表达的改变倍数显示为?。在b)中，在SAHA 5μΜ存在 下，VSV Δ 51诱导的基因表达的改变倍数显示为〇。
[0086] 图15显示VSel在免疫活性小鼠中和在人类临床样品中表现出VSVA 51敏化活性的 结果。a)第一次处理前11天，在同基因的Balb/C小鼠中皮下（s.c)植入3X105#VSVA5U9 CT26细胞。第11天(Dll)时，以0.4mg/小鼠腹膜内（i . p)施用VSe 1 (或载剂）。4小时之后，肿瘤 内（i.t)施用1\10^￥451(或1^)。在第13和15天，施用另外两个剂量的￥361。使用卡尺 测量小鼠肿瘤体积，并显示相对于D11的平均肿瘤体积。误差条表示标准误、<0.005，》p <0.05，**、<0.1(六如￥六）<^ = 5只小鼠/组。b)用载剂（中图）或40μΜ VSel处理24小时之 后，以1X107PFU的表达GFP的VSVA51(或roS，上图）感染的代表性人结肠肿瘤的切片的伪 色(LUT)荧光显微镜图像。照片是孵育72小时之后拍摄的。c)按照b)用20或40μΜ VSel处理 人肿瘤或正常组织切片。72小时之后，收集组织样品，并将其匀浆，用于随后通过蚀斑测定 法用Vero细胞测定滴度。
[0087] 图16显示表明VSel不增加 VSVA 51在正常小鼠组织中之复制的结果。与图15a中显 示的处理方案相类似地处理Balb/C小鼠。简单地说，腹膜内（i.p)提供第一剂量的0.4mg VSel (或载剂），4小时之后用1 X 108PFU表达GFP的VSV Δ 51静脉攻击。48和96小时之后，i . p 再次施用VSel 0.4mg(或载剂），并在感染后第6天处死小鼠。收集器官，并立即使用荧光解 剖显微镜来使其可视化。GFP显示与正上方显示的相差(Ph.C)图像相关联的GFP荧光照片。 在任何器官中，均未观察到GFP信号。
[0088]图17显示表明DCroF(VSel)及其类似物增强VSVA 51在细胞中之扩散的结果。在以 0.01的Μ0Ι用表达GFP的VSVA51感染之前4小时，用20μΜ药物或对照预处理4T1小鼠乳腺癌 细胞。对于母化合物，两个重复地进行两次实验。病毒感染之后大约48小时，拍摄荧光照片， 并显示在(a)中。随后，使用考马斯蓝测定来测定(b)中的细胞毒性。收集上清液，并使用标 准的蚀斑测定法，用Vero细胞测定病毒颗粒的滴度(c)。数据表示三次独立实验的平均值/ ρ = 9·39Χ10-4，**ρ = 6·7Χ10-4，***口 = 0.14，牝=0.74，#牝=0.34，##牝=0.60(不成对、 不等方差Τ检验）。以误差条表示标准误。（d)不同浓度的每种药物对4Τ1细胞的细胞毒性。 (e)高浓度的DCPDF和二溴取代的DBTOF对4T1细胞的细胞毒性。接受20μΜ药物剂量之后48小 时，使用阿尔玛蓝(alamar blue)?试剂测量细胞生存。相对于对照孔来标化细胞生存。其 值为以两个重复进行的三次分开实验的平均值，*P = 9.97X10-3，**p = 3.75X10-5，^、= 4 · 58 X 10-6，#p = 1 · 79 X 10-2，= 4 · 24 X 10-5 (不成对、不等方差T检验）。以误差条表示标 准误。
[0089]图18显示多种微管去稳定剂增强VSV诱导之细胞毒性的结果。用指定浓度的微管 去稳定剂预处理4T1 (a)和CT26(b)细胞4h，所述微管去稳定剂包括帕苯达唑 (parbendazole，Parb)、秋水仙素（colchicine，Colch)、阿苯达唑（albendazole，alben)、诺 考达挫(nocodazole，Noco)、长春瑞滨喊(Vinorelbine base，Vino)。测定VSVA 51 存在和不 存在下药物的细胞毒性，并将其用于计算VSV/对照杀伤率(kill ratio)，所述杀伤率等于 相对于仅VSV对照的药物存在时的细胞生存除以相对于未感染对照的药物的细胞毒性。1以 下的值(虚线)表明，在给定浓度下，该药物比预期VSV存在时更有效。
[0090]图19显示秋水仙素是VSVA 51在肿瘤细胞中扩散的强大增强剂的结果。a)以降低 剂量的秋水仙素预处理之后，用表达绿色焚光蛋白（green fluorescent protein，GFP)的 VSV Δ 51，以0.01的Μ0Ι感染人U251、786-0和小鼠4T1细胞。孵育48小时之后，拍摄荧光显微 照片。在低至80nM的剂量下，观察到了强烈增强的VSV Δ 51 (GFP)扩散。在b~d)中，在48小时 时收集上清液，并使用标准蚀斑测定法将所述上清液用于评价病毒滴度。秋水仙素可强烈 增强(高达近1000倍)病毒产生。
[0091]图20显示秋水仙素不调节IFN应答的结果。用秋水仙素或对照预处理对IFN应答的 U251细胞4小时，随后添加人IFN-a 4小时，接着用表达GFP的VSVA51攻击。进行考马斯染 色以评价细胞毒性(上方两个图）。如预想的那样，IFN阻断了 VSV的复制，并且尽管秋水仙素 增强了 VSV的溶瘤作用，但其不能克服IFN诱导的抗病毒作用，这表明，相对于其他病毒敏化 剂(例如VSel)，IFN应答的调节并不有助于秋水仙素的作用模式。
[0092]图21显示秋水仙素增加野生型VSV和VSVA 51介导之溶瘤作用的结果。在A)中，用 秋水仙素或对照预处理多种小鼠和人的癌细胞，以及正常的人MRC-5细胞，然后用野生型 VSV(wtVSV)或表达绿色荧光蛋白（GFP)的VSVA51攻击所述细胞。感染后48小时，拍摄荧光 显微照片。秋水仙素增强VSVA51的扩散，但似乎降低使用wtVSV的GFP阳性细胞的数目。b) 中显示的结果表明GFP阳性细胞的降低很可能是因为增强杀伤wtVSV感染的细胞。还要注意 的是，在正常的MRC-5细胞中，并未观察到a)中增强的VSVA 51扩散，这表明在微管去稳定剂 存在下，VSV △ 51对肿瘤细胞的选择性得以维持。
[0093]图22显示多种VSe化合物可以增加痘苗病毒之复制的结果。用ΙΟμΜ每种VSe化合物 预处理之后，以0.1的Μ0Ι用痘苗病毒感染4T1细胞并孵育48小时（相关结构参照表2中的VSe 代号)之后。用标准蚀斑测定法用U20S细胞评价病毒滴度。直方图上方的数字表示病毒滴度 相对于对照的增加倍数。
[0094]图23显示VSel、6和7可以增强制造 MDCK的细胞中两种流感疫苗病毒株之产生的结 果。用指定浓度的药物预处理汇合的MDCK细胞4小时，然后用低Μ0Ι (0.001)的流感H1N1疫苗 毒株FM/1/47和PR8攻击所述细胞。值得注意的是，WHO和疫苗制造商使用PR8毒株来生产含 有来自季节性流感毒株的血凝素（H)和神经氨酸酶（N)基因的重排病毒（reassortant virus)。感染后48小时，收集上清液，并用中性红测定法评价TCID50。在该实验中，使用VSe 化合物观察到病毒滴度增加3至6个数量级，这表明这些化合物可用于疫苗制造过程。
[0095]发明详述
[0096] 以下描述是优选的方案。
[0097] 第一个方面，提供了增加或增强病毒在癌细胞、肿瘤或永生化细胞(例如，CT-26、 4T1乳腺癌细胞、786-0、U-251、B16黑色素瘤细胞和结肠肿瘤）中而非在正常或非永生化细 胞中扩散的化合物。
[0098]另一方面，提供了增加或增强病毒在细胞（例如，CT-26细胞、786-0、4Τ1、结肠肿 瘤、外阴肿瘤和骨肿瘤细胞)中而非在正常或非永生化细胞中滴度化合物。
[0099] 另一方面，提供了增加病毒(尤其是溶瘤病毒)在细胞中细胞毒性的化合物。
[0100] 基于本文中描述的多种广泛的筛选中所获得的特定化合物的结果，并考虑从多种 结构-功能分析中获得的结果，鉴定了广泛类型的化合物和多种亚类，其表现出一种或更多 种上文中描述的特性，或可在体内或体外实验或在常规结构-功能分析中作为对照使用，以 测定具有本文中描述的感兴趣的特征的其他化合物。
[0101] 本发明涉及下式的病毒敏化化合物
[0103] 其N-氧化物、药学上可接受的加成盐、季胺或立体化学异构体形式，其中：
[0104] A是包含1~4个杂原子和1或2个双键的5元杂环，所述杂原子选自0、N或S;
[0105] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0106] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0107] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基，和
[0108] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0109 ]感兴趣的一组化合物是这样的式(I)化合物
[0110] 其中，
[0111] A是
[0112]
[0113] 父:是~順或S;
[0114] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0115] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0116] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基，和
[0117] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0118] 感兴趣的另一组化合物是这样的式(I)化合物，例如但不限于下式
[0120] 其中，
[0121] 父丄是^順或S;
[0122] 父2、父3和父4独立地是(：或1
[0123] X5 是 C;
[0124] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0125] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0126] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基；
[0127] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基；
[0128] 其中原子X2和X3之间的键是单键或双键；
[0129] 其中原子Χ3和Χ4之间的键是单键或双键；
[0130]其中原子Χ4和Χ5之间的键是单键或双键；
[0131] 其中原子Χ5和Xi之间的键是单键或双键；
[0132] 其中当原子X2和X3之间的键与Χ4和X5之间的键各自是单键时，原子X 3和X4之间的键 是双键，原子Χ5和Xi之间的键是单键，Χ2是C，并且R1是氧代;或者
[0133] 其中当原子Χ2和Χ3之间的键与Χ4和Χ5之间的键各自是单键时，原子Χ 3和Χ4之间的键 是双键，原子Χ5和乂:之间的键是双键，并且乂:是?^，或者
[0134] 其中当原子X2和X3之间的键与Χ4和X5之间的键各自是双键时，原子X 3和X4之间的键 是单键，并且原子Χ5和心之间的键是单键。
[0135] 感兴趣的另一组化合物是这样的式(I)化合物，例如但不限于式(III)
[0137] 其中：
[0138] 父:是~順或S;
[0139 ] R2是烷基、卤素、羧基或羟基；
[0140] R3是烷基或卤素，和
[0141] R4是烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0142] 感兴趣的另一组化合物是这样的式(I)化合物，例如但不限于
[0146]
3，5-二甲基-4- {[ (2-氧代-3-氮杂环庚烷基)氨基]磺酰基} 1H- 吡咯-2-羧酸乙酯；
[0150]本发明还涉及下式的化合物
[0152] 其中，
[0153] X是 0或 S;
[0154] R5是羟基烷基、杂芳基、未取代的芳基、以1或多个选自烷基和卤素的取代基取代 的芳基、杂环基或苯并二氧杂环烷基烷基;和
[0155] R6是氨基、芳基或以1或多个选自烷基和卤素的取代基取代的芳基。
[0156] 感兴趣的另一组化合物是这样的式(IV)化合物，例如但不限于
[0162] 表1中列出另一些感兴趣的化合物。
[0163] 表1. 一些病毒敏化化合物的结构和化学名称




[0169]如下表2中描述了另一些感兴趣的病毒敏化化合物，并且其可用其化学名称、代号 或结构来表示。
[0170]表2:另一些病毒敏化化合物的结构、化学名称和参考代号


[0174] 术语"病毒敏化化合物"或"病毒敏化剂"意为这样的化合物，所述化合物增加或增 强病毒(优选遗传修饰的病毒或减毒的病毒，更优选溶瘤病毒）在一种或更多种类型细胞 (优选癌或肿瘤细胞而非正常或非永生化细胞；）中的扩散;增加或增强溶瘤病毒对抗一种 或更多种癌或肿瘤细胞的细胞毒性/溶瘤活性;增加或增强病毒(更优选遗传修饰的、减毒 的或溶瘤病毒）的产生、产量或繁殖能力;或上述的任何组合。还优选通过杀伤癌或肿瘤细 胞或一段时间内限制其生长来降低癌或肿瘤细胞生存的病毒敏化化合物。
[0175] 术语"溶瘤病毒"意为与正常细胞相比偏好感染或溶解癌或肿瘤细胞的病毒。病毒 的细胞毒性/溶瘤活性可在体外、体内或二者中存在、观察到或展示出。优选地，所述病毒表 现出体内细胞毒性/溶瘤活性。现有技术中已知的溶瘤病毒的示例包括但不限于呼肠孤病 毒、新城疫病毒、腺病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、流感病毒、痘 苗病毒、弹状病毒、水疱性口炎病毒和其衍生物/变体。
[0176] 病毒的"衍生物"或"变体"意为通过在不同的生长条件下选择病毒所获得的病毒， 所述病毒经受一系列的选择压力，所述病毒通过使用现有技术中已知的重组技术而被遗传 修饰，或其任何组合。这种病毒的示例是现有技术中已知的，例如US专利申请20040115170、 20040170607、20020037543、W0 00/62735;美国专利7,052，832、7,063，835、7,122,182(其 通过引用并入本文)等。优选的病毒是水疱性口炎病毒(VSV)，或其变体/衍生物(例如在特 定的生长条件下选择），所述病毒经受一系列的选择压力，所述病毒通过使用现有技术中已 知的重组技术而被遗传修饰，或其组合。在一个优选的实施方案中，所述病毒是VSVA 51 (Stojdl et al.,VSV strains with defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents·，Cancer Cell.2003 Oct；4(4)： 263-75，其通过引用并入本文）。
[0177] 术语"烷基"意为具有1至20个碳原子(更优选1至8个碳原子，或更尤其是1至6个碳 原子）的直链或支链烷基。烷基基团的示例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲 丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、2-乙基己基、1，1，3,3_四甲基丁基、 壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基和二十烷基。
[0178] -种或更多种类型的癌或肿瘤细胞可以是来自任何细胞、细胞系、组织或生物(例 如但不限于人、大鼠、小鼠、猫、狗、猪、灵长类、马等)的体外或体内的癌细胞。在一个优选的 实施方案中，所述一种或更多种癌或肿瘤细胞包含人癌或肿瘤细胞，所述人癌或肿瘤例如 但不限于淋巴母细胞性白血病、髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关的癌、AIDS相关的 淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎/横纹肌肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀 胱癌、骨癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑 星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、颅咽管瘤、室管膜母细胞瘤、髓母细胞瘤、中等分化的松果体 实质肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤、脊 髓肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、类癌肿瘤、中枢神 经系统淋巴瘤、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生 性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、 食管癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼内黑色素瘤、视网 膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST)、胃肠间质细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤、颅外、性腺外、卵巢、妊娠滋养细胞肿瘤、 神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞（肝）癌、组织细胞增生症、朗格汉斯细胞癌 (Langerhans cell cancer)、霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma)、下咽癌、胰岛细胞肿瘤、 卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、喉癌、淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、唇和口腔 癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma)、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、眼内黑色 素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性 内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、 口腔癌、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体实质肿瘤、 成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体肿瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜 肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管 癌、移行细胞癌、呼吸道癌、视网膜母细胞癌、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、子宫肉瘤、皮肤癌、梅 克尔细胞皮肤癌(Merkel cell skin carcinoma)、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状 颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状 腺癌、滋养层细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌或维尔姆斯 瘤(Wi lms tumor)。然而，本文中描述的化合物和组合物可用于治疗体内或体外的任何其他 癌或肿瘤。
[0179] 本发明还提供组合物，所述组合物包含a)本文中描述的一种或更多种病毒敏化化 合物和b) -种或更多种其他成分，例如但不限于载体、稀释剂或赋形剂，药学上可接受的载 体、稀释剂或赋形剂，病毒(例如但不限于减毒的病毒、遗传修饰的病毒或溶瘤病毒），癌或 肿瘤细胞，非癌细胞，细胞培养基，一种或更多种癌治疗剂(例如但不限于化疗剂）。作为示 例(但不被认为是以任何方式的限定），环磷酰胺(cyclophosphamide，CPA)是常用的化学治 疗药物，其主要用于治疗淋巴瘤，慢性淋巴性白血病和乳腺、卵巢和膀胱癌。CPA通过肝氧化 酶被转化成为其活性代谢产物4-羟基环磷酰胺和醛磷酰胺。与HSV(15~18)、腺病毒（19)、 麻疹病毒(20)、呼肠孤病毒(21，22)和痘苗病毒(23)联合使用CPA作为免疫抑制剂以增强病 毒的溶瘤作用已经改进了病毒治疗的效力。
[0180] 顺铂结合并交联细胞DNA，当DNA未被修复时导致凋亡。已研究了顺铂与溶瘤腺病 毒(25~34)、疱疹病毒(35~37)、细小病毒(38)、痘苗病毒(39)和水疱性口炎病毒(40)的联 合。当将顺铂与腺病毒、疱疹病毒、细小病毒和痘苗病毒联合时，观察到了体外和体内增强 的治疗活性，而对于水疱性口炎病毒，则观察到了轻微的抑制。
[0181] 丝裂霉素 C(Mitomycin C，MMC)是具有抗肿瘤特性的DNA交联抗生素。MMC表现出与 HSV协同的细胞毒性(40,41)。体内联合疱疹病毒和1^(：显著提高胃癌病(43)和非小细胞肺 癌(41)模型中的治疗作用。
[0182] 多柔比星是嵌入DNA并阻止拓扑异构酶II之作用的蒽环类抗生素。当与溶瘤腺病 毒联合时，多柔比星是协同细胞毒性的（42,44)，并且相对于单独治疗，所述联合降低肿瘤 生长(45) WNYX-015与MAP(丝裂霉素 C、多柔比星和顺铂)化学治疗成功地在I~II期临床试 验中联合，用于治疗晚期肉瘤(30)。
[0183] 更昔洛韦（ganCycl〇Vir，GCV)是广泛使用的抗病毒剂，起初开发用于治疗巨细胞 病毒感染。GCV是鸟苷（guanasine)类似物前药，在被疱疹病毒胸苷激酶（thymidine kinase，TK)磷酸化时，其与细胞dGTP竞争整合进入DNA，导致延长终止。溶瘤病毒编码HSV TK基因，导致毒性GCV代谢产物在肿瘤细胞内积聚，这干扰了细胞DNA合成，导致凋亡(46)。 在人卵巢癌(47)和大鼠神经胶质肉瘤(48)模型中，与GCV联合的靶向溶瘤HSV病毒显著提高 的存活。与GCV联合时，经改造表达HSV TK基因的腺病毒也表现出增强的抗肿瘤活性(49~ 51)〇
[0184]⑶/5-FC酶/前药治疗也被证明与溶瘤病毒治疗成功地联合。5-FU是抑制胸苷合成 的嘧啶类似物。当与5-FC治疗联合用于免疫活性的卵巢癌（52)和免疫抑制的结肠癌模型 (53,54)时，两种不同的表达CD的痘苗病毒的抗肿瘤活性显著增强。
[0185] 紫杉烷是一类化学治疗药物(包括紫杉醇和多烯紫杉醇），其可导致细胞微管的稳 定化，从而阻止细胞骨架的功能(有丝分裂所需要的）。多烯紫杉醇或紫杉醇与尿路上皮或 前列腺靶向的腺病毒联合显著地降低体内肿瘤体积，并导致协同的体外细胞毒性(55,56)。
[0186] 雷帕霉素(西罗莫司）是常用于移植患者的免疫抑制剂，然而其也被证明显著增强 痘病毒黏液瘤和痘苗病毒的溶瘤作用(23,57~59)。
[0187] 原型的蛋白酶体抑制剂MG-132增强Lovo结肠癌细胞中的细胞CAR表达，其伴有增 强的腺病毒靶基因表达和溶瘤作用(60)。
[0188] 通过与BCL-2抑制剂EM20-25联合治疗，增加了溶瘤的VSV对抗慢性淋巴细胞性白 血病细胞的效力(61)。
[0189] -个组证明，在溶瘤病毒治疗之前，单剂量的血管生成抑制的cR⑶肽治疗增强溶 瘤HSV的抗肿瘤效力（24,62)。
[0190] 本发明还提供试剂盒，所述试剂盒包含一种或更多种病毒敏化化合物或包含所述 化合物的组合物。所述试剂盒还可包含细胞培养皿/板或多孔皿/板，向细胞、细胞培养物 或细胞培养基或向对象体内递送所述病毒敏化化合物或包含所述化合物的组合物的装置。 所述试剂盒还可包含用于施用或使用所述病毒敏化化合物、病毒(例如但不限于减毒的病 毒、遗传修饰的病毒、溶瘤病毒、其任何组合，或不同病毒的任何组合)的说明书。
[0191] 对于体内治疗应用，提供了药物组合物，其包含一种或更多种病毒敏化化合物和 药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，任选地含有另一些溶质（例如，溶解的盐等）。在一 个优选的实施方案中，该溶液包含足够的盐水或葡糖糖以使溶液等张。药物组合物和制备 药物组合物的方法是本领域中已知的，并且描述于例如"Remington:The Science and Practice of Pharmacy"（以前称为"Remingtons Pharmaceutical Sciences"）；Gennaro， A.，Lippincott，Williams&Wilkins，Philidelphia，PA(2000)，其通过引用并入本文。
[0192] 可通过多种途径施用这样的组合物，所述途径取决于是否需要局部和/或全身治 疗和要治疗的区域。在并不意在限制的第一个实施方案中，将病毒敏化化合物局部施用至 要治疗的区域。施用可为局部施用（包括眼科和黏膜(包括阴道和直肠递送））、肺施用（例 如，通过吸入或喷射粉末或气雾剂(包括通过喷雾器））、气管内施用、鼻内施用、表皮和经皮 施用、口腔或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输 注，或颅内（例如，鞘内或脑室内）施用。还考虑肿瘤内注射、灌注或递送进入肿瘤附近的广 泛区域或注射进入供给肿瘤的血管系统。或者，可以以片剂或胶囊剂来配制病毒敏化化合 物，用于口服施用。也可考虑本领域中已知的其他剂型。
[0193] 对于吸入或喷射施用，可将病毒敏化化合物配制成为水溶液或部分水溶液，所述 溶液可以以气雾剂的形式使用。对于局部使用，该调节剂可在药学上可接受的载剂中配制 为应用于皮肤受影响部分的撒粉(dusting powder)、乳膏或洗剂。
[0194] 本发明的病毒敏化化合物的剂量要求随所采用的具体组合物、施用途径和要治疗 的具体对象的不同而不同。可通过本领域技术人员已知的标准临床技术来确定剂量要求。 一般来说，通常以低于该化合物最适剂量的小剂量开始。此后，增加剂量直到达到该条件下 的最适作用。一般来说，以这样的浓度施用所述病毒敏化剂或包含所述病毒敏化剂的药物 组合物，所述浓度一般会提供有效的结果而不引起显著的伤害的（harmful)或有害的 (deleterious)副作用。施用可为单个单位剂量或(如果需要的话)所述剂量可分成在全天 合适的时间施用的方便的亚单位。
[0195] 可按顺序施用来使用病毒敏化化合物，例如，施用病毒（例如但不限于减毒的病 毒，遗传修饰的病毒或溶瘤病毒)之前、之后或之前并且之后施用。或者，可与上文中描述的 病毒联合施用病毒敏化化合物，优选与溶瘤病毒联合。此外，可与上文中描述的溶瘤病毒一 起使用病毒敏化剂，并且与一种或更多种本领域技术人员已知的癌治疗联用，所述治疗例 如但不限于干扰素治疗、白介素治疗、集落刺激因子治疗、化学治疗药物，所述化学治疗药 物例如但不限于5-氟脱氧尿苷、安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡钼、卡莫司汀、苯丁 酸氮芥、顺钼、克拉屈滨、氯法拉滨、克立他酶(crisantaspase)、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡 巴嗪、放线菌素 D、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧 啶、吉西他滨、格立得(gliadel)、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、亚叶酸、洛莫司 汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、 喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙钼(satraplatin)、链佐星、替加氟-尿啼啶、替莫唑胺、替 尼泊苷、塞替派、硫鸟噪呤、拓扑替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或 其组合。此外，还可使用抗癌生物制品(anti-cancer biolgics)，例如单克隆抗体等。
[0196] 本发明还考虑本文中描述的化合物用于增加或增强病毒(例如，遗传修饰的病毒、 减毒的病毒或溶瘤病毒)在一种或更多种细胞(例如但不限于一种或更多种癌或肿瘤细胞） 中扩散，增加或增强溶瘤病毒对抗一种或更多种癌或肿瘤细胞的细胞毒性/溶瘤活性，增加 或增强病毒（例如，遗传修饰的病毒、减毒的病毒、溶瘤病毒或上述病毒的任何组合）的产 生、产量或繁殖能力的方法和用途。在一个不是意在以任何方式进行限制的具体实施方案 中，所述病毒敏化化合物通过杀伤癌或肿瘤细胞或在一段时间内限制其生长而降低癌或肿 瘤细胞的生存。还可使用所述化合物用于生产实现相同目的的药物。
[0197] 在本发明的一个实施方案中，提供了包含本文中描述的病毒敏化化合物的组合 物，所述化合物例如以下的一种或更多种:3，4-二氯-5-苯基-2，5-二氢呋喃-2-酮、2-苯基-1H-咪唑-4-羧酸1.5水合物、3-[5-(2,3_二氯苯基)-2Η-1，2,3,4-四唑-2-基]丙酰肼、3,5_ 二甲基-4-{ [(2-氧代-3-氮杂环庚烷基)氨基]磺酰基}1H-吡咯-2-羧酸乙酯、2-氨基-5-苯 基-3-噻吩羧酸、3-[(喹啉-6-基羰基)氨基]噻吩-2-羧酸甲酯、5-( 2-氯-6-氟苯基)-3-羟 基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮和5-(2，6-二氯苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮、N-(3,4-二甲基苯基)-1/-(2-吡啶基)硫脲、Nl-(2,6-二乙基苯基)肼-1-硫代甲酰胺、N-(2-羟基乙基)-Y-(2-甲基苯基)硫脲、Nl-(2-氯-6-甲基苯基)肼-1-硫代甲酰胺、N-(4-氯 苯基)-^-(2,3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己-2-基甲基)脲、4-(苄氧基)-2-甲基-1-硝基苯、 1-{4-[(2_甲基喹啉-4-基)氨基]苯基}乙-1-酮、Nl-(1，2,3，10-四甲氧基-9-氧代_5,6,7， 9_四氢苯并[a]庚搭烯-7-基）乙酰胺、N-[4-(二甲基氨基）亚苄基]氨基甲腙酸硫甲酯、N-(4-氯苯基)-(二甲基氨基）甲酰亚胺硫甲酯氢碘酸盐、4人二氢-4M5-甲氧基苯基）螺 [2H-1-苯并噻喃吡唑]-4-酮、1H-苯并[d]咪唑-2-硫醇、N-(2-呋喃基亚甲 基)-(4-{[(2_呋喃基亚甲基)氨基]甲基}环己基）甲胺;2-[4-(二乙氧基甲基)亚苄基]丙二 臆;2-(环丙基幾基)_3_(3-苯氧基_2_噻吩基)丙稀臆;-(3,5-二氯苯基)_2,4-二氣苯甲 酰肼；1〇_(羟基亚甲基)菲-9(10H)_酮;Nl-(2,5-二氟苯基)-4-({[4-(三氟甲基)苯基]磺酰 基}氨基)苯-1-磺酰胺;N-[4-(4-氯苯基)-2,5_二氧代哌嗪基]-2-(2,3-二氢-1H-吲哚-1-基）乙酰胺、4_{ [ (4_{ [ (3-羧基丙稀酰基)氨基]甲基}环己基）甲基]氨基}_4_氧代-2-丁稀 酸;5-氧代-3-苯基-5-{4-[3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-1-基]苯胺基}戊酸、Nl-(4-氯苯基)-2-({4-甲基-5- [ 1 -甲基-2-(甲基硫代)-1H-咪唑-5-基]-4H-1，2，4-三唑-3-基}硫代）乙酰胺、 6- [2-(4_甲基苯基)-2-氧代乙基]-3-苯基_2,5_二氢-1，2,4-三嗪-5-酮;Nl-[2-(叔丁基)- 7- 甲基-5-(三氟甲基）吡唑并[l，5-a]嘧啶-3-基]乙酰胺;4-(2,3_二氢-1H-茚-5-基）-6-(三氟甲基）嘧啶-2-胺；1-(2,3_二氢-1-苯并呋喃-5-基磺酰基)-4-哌啶羧酸乙酯、2,3_二 苯基环丙-2-烯-1-酮、1-环十二烷基-1H-吡咯-2，5-二酮、1-(4-甲基苯基)-2，5-二氢-1H-吡咯_2,5_二酮、2-[(4_苯氧基苯胺基）甲基]异二氢吲哚-1，3-二酮、2-{[1-(3_氯-4-甲基 苯基)-2,5_二氧代四氢-1H-吡咯-3-基]硫代}苯甲酸、1-(1，3_苯并二氧杂环戊-5-基甲 基)-2,5-二氢-1!1-吡咯-2,5-二酮、4-氯4-[3-氯-2-(异丙基硫代）苯基]苯甲酰胺和1 ({5_[ ({2_[ (2-咲喃基甲基)硫代]乙基}氨基)横酰基]_2_噻吩基}甲基)苯甲酰胺、帕苯达 P坐、甲硫苯唑(methiazole)、秋水仙素、长春瑞滨碱、4-氨基-2-苯胺基-5-硝基噻吩-3-羧酸 乙酯、2-[二（甲基硫代)亚甲基]丙二腈、草酸N-(1H-吲哚-3-基甲基)-N-甲基-2-苯基乙胺、 3-(2-呋喃基)-N-(4,5,6,7-四氢-1，3-苯并噻唑-2-基)丙烯酰胺、阿苯达唑、草酸2-苯基-4_喹啉胺、紫杉醇、诺考达唑、（2，5-二甲氧基苯基）[(2-甲氧基-1-萘基）甲基]胺、DBPDF、 BB90、L1EA、R1EA 或 LT33(化学结构见图 17)。
[0198] 在另一个实施方案中，提供了包含上文中描述的病毒敏化化合物的组合物，只是 所述组合物不包含一种或更多种选自以下的化合物:3，4-二氯-5-苯基-2，5-二氢呋喃-2-酮、2-苯基-1H-咪唑-4-羧酸1.5水合物、3-[5-(2,3_二氯苯基)-2Η-1，2,3,4-四唑-2-基] 丙酰肼、3，5-二甲基-4- {[ (2-氧代-3-氮杂环庚烷基)氨基]磺酰基} 1 Η-吡咯-2-羧酸乙酯、 2-氨基-5-苯基-3-噻吩羧酸、3-[(喹啉-6-基羰基)氨基]噻吩-2-羧酸甲酯、5-( 2-氯-6-氟 苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮和5-( 2，6-二氯苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二 氢呋喃-2-酮、N-(3,4-二甲基苯基)-1/-(2-吡啶基)硫脲、Nl-(2,6-二乙基苯基)肼-1-硫代 甲酰胺、N-(2-羟基乙基）-(2-甲基苯基)硫脲、Nl-(2-氯-6-甲基苯基)肼-1-硫代甲酰 胺、N-(4-氯苯基）-^-(2,3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己-2-基甲基）脲、4-(苄氧基)-2-甲 基-1-硝基苯、1-{4-[(2_甲基喹啉-4-基)氨基]苯基}乙-1-酮、Nl-(l，2,3，10-四甲氧基-9-氧代-5,6,7,9-四氢苯并[a]庚搭烯-7-基）乙酰胺、N-[4-(二甲基氨基)亚苄基]氨基甲腙酸 硫甲酯、N-(4-氯苯基)-(二甲基氨基）甲酰亚胺硫甲酯氢碘酸盐、4人二氢-4M5-甲氧 基苯基)螺[2H-1-苯并噻喃-3(4Η)π^-[3Η]吡唑]-4-酮、1H-苯并[d]咪唑-2-硫醇、N-(2-呋 喃基亚甲基)-(4-{[(2_呋喃基亚甲基)氨基]甲基}环己基）甲胺；2-[4-(二乙氧基甲基）亚 苄基]丙二臆;2_(环丙基幾基)_3_(3-苯氧基_2_噻吩基)丙稀臆;- (3，5-二氯苯基)-2，4-二氟苯甲酰肼；1〇_(羟基亚甲基）菲-9(10H)_酮;Nl-(2,5-二氟苯基)-4-({[4-(三氟甲基） 苯基]磺酰基}氨基)苯-1-磺酰胺;N-[4-(4-氯苯基)-2,5_二氧代哌嗪基]-2-(2,3-二氢-lH-吲哚-1-基）乙酰胺、4-{[(4-{[(3-羧基丙烯酰基)氨基]甲基}环己基）甲基]氨基}-4-氧 代-2-丁烯酸;5-氧代-3-苯基-5-{4-[3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-1-基]苯胺基}戊酸、Nl-(4-氯苯基)-2-({4-甲基-5-[1-甲基-2-(甲基硫代)-1!1-咪唑-5-基]-4!1-1，2,4-三唑-3-基}硫 代）乙酰胺、6-[2-(4_甲基苯基)-2-氧代乙基]-3-苯基-2，5-二氢-1，2，4_三嗪-5-酮;N1-[2-(叔丁基)-7-甲基-5-(三氟甲基）吡唑并[l，5-a]嘧啶-3-基]乙酰胺;4-(2,3_二氢-1H-茚-5-基)-6-(三氟甲基）嘧啶-2-胺；1-(2,3_二氢-1-苯并呋喃-5-基磺酰基)-4-哌啶羧酸 乙酯、2，3-二苯基环丙-2-烯-1-酮、1-环十二烷基-1H-吡咯-2，5-二酮、1-(4-甲基苯基)-2， 5-二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、2-[(4_苯氧基苯胺基）甲基]异二氢吲哚-1，3-二酮、2-{[1-(3_ 氯-4-甲基苯基)-2，5-二氧代四氢-1H-吡咯-3-基]硫代}苯甲酸、1-( 1，3-苯并二氧杂环戊-5-基甲基)-2,5_二氢-1H-吡咯-2,5-二酮、4-氯-N-[3-氯-2-(异丙基硫代)苯基]苯甲酰胺 和N-({5-[({2-[(2-呋喃基甲基)硫代]乙基}氨基)磺酰基]-2-噻吩基}甲基)苯甲酰胺、帕 苯达唑、甲硫苯唑、秋水仙素、长春瑞滨碱、4-氨基-2-苯胺基-5-硝基噻吩-3-羧酸乙酯、2-[二（甲基硫代)亚甲基]丙二腈、草酸N-(1H-吲哚-3-基甲基)-N-甲基-2-苯基乙胺、3-(2-呋 喃基)-^(4,5,6,7-四氢-1，3-苯并噻唑-2-基）丙烯酰胺、阿苯达唑、草酸2-苯基-4-喹啉 胺、紫杉醇、诺考达唑或（2,5-二甲氧基苯基）[(2-甲氧基-1-萘基）甲基]胺、08?0?、8890、 L1EA、R1EA或LT33。
[0199] 如本领域技术人员会理解的那样，可单独或在本领域技术人员所需要的任何多种 组合物中联合使用本文中鉴定的一般类的结构和具体化合物。不希望受理论限制，本文中 描述的化合物的潜在用途可选自：在特定细胞中增加扩散和/或病毒滴度(例如，在癌或肿 瘤细胞/组织或来自永生化培养物的细胞中），在特定细胞中增加病毒的细胞毒性(包括溶 瘤病毒），例如，在癌或肿瘤细胞/组织中，用于生产病毒，所述病毒随后可用于生产疫苗。此 外，重要的是，本文中描述的化合物还可用作内对照或用于结构-功能分析，以确定表现出 与本文现在描述的化合物类似或改进特性的其他类或特定分子。
[0200] 用于鉴定病毒敏化剂的高通量筛选
[0201] 抗病毒信号通路涉及跨越从细胞质膜(例如，TLR和IFN受体），通过细胞质（例如， IKK、Jak RIG-I)，进入核(例如，11^、3了41\即-仙），并再次出来的多层调控。不希望受理论 限制或以任何方式限制，这表明高通量的、基于感染细胞的筛选可潜在地鉴定病毒敏化化 合物，所述化合物在增强病毒复制等多水平上是有活性的。为了验证该想法，进行了对12， 280种合成的药物样分子的联合VSVA 51和乳腺癌细胞系(4T1)(其被认为仅部分地容许该 特定的病毒）的初始筛选。我们比较和对比了给定化合物单独的或与低剂量的本文中描述 的VSVA 51联合的细胞毒性。使用低浓度的病毒(0.03蚀斑形成单位/细胞）以使病毒单独引 起测定时间内最小细胞死亡，因此有利于选择促进病毒在细胞培养物中复制和扩散的化合 物。多种化合物似乎增加病毒对4T1细胞的杀伤，并且在第二轮的筛选中测试这些先导候选 物(参见例如图11a的散点图）。为验证的目的，在所选的化合物存在下，将编码一个版本的 VSVA 51添加至单层4T1细胞。24小时后，观察被感染的培养物，并通过RFP的表达来估计病 毒扩散的程度。在载剂处理的培养物中，仅检测到小的表达RFP之细胞的灶，而很多通过高 通量筛选初始选择的化合物似乎在单层中的多数细胞中增强病毒的扩散和RFP的表达。感 染之后48小时，收集来自被感染培养物的上清液，并且测定病毒滴度。当与载剂处理的对照 相比时，本文中描述的优选化合物所引起的病毒扩散的增加与提高的病毒输出相关。在一 些验证的化合物中，8个是已知的微管靶向剂，并且据我们所知，剩余的是以前未表征的合 成化合物。我们选择四种对VSVA 51天然耐受的癌细胞系，并测试VSel增强病毒复制和扩散 的能力。该结果表明，VSel在不同类型的人类和小鼠来源的恶性疾病中有活性。重要的是， 即便是在VSel存在下，正常的成纤维细胞系GM-38仍然耐受VSVA51的感染，这表明所述化 合物在转化的细胞系中更有活性。增强的病毒扩散与病毒产生的剂量依赖性增加相关，在 VSel存在下，一些高度耐受的细胞系(例如786-0)表现出病毒滴度1000倍的增加(参见例如 图12a)。所计算的联合指数也表明VSe 1对VSV △ 51扩散的作用也转化成为协同的细胞杀伤。 我们也注意到VSel具有最小的在CT26细胞系中增强具有野生型Μ基因的VSV生长的能力，而 同时超过一百倍地增加 VSVA 51的滴度。当测试VSel增强溶瘤版本的痘苗病毒(VVdd)(多样 的DNA病毒平台）的能力时，我们发现虽然该作用某种程度上没有VSV △ 51强烈，VSel也能够 增强该病毒的扩散和复制。
[0202] VSel破坏抗病毒信号
[0203] 我们检测了 VSel阻断干扰素激活之转录程序的能力。用含有萤光素酶基因的报道 质粒转染HEK 293细胞，所述基因在干扰素应答的启动子原件（interferon responsive promoter element，ISRE)的控制下。当用人干扰素 α处理时，转染的细胞以剂量依赖方式表 达萤光素酶，然而干扰素依赖性的转录可通过向培养物中添加增加剂量的VSel而被钝化 (参见例如图13A)。此外，虽然干扰素可保护神经胶质瘤细胞系U251免受VSVA51感染，但可 通过用VSel共处理而部分克服该保护作用（图13B)。
[0204] VSel抑制病毒诱导的细胞基因表达
[0205]不希望受理论的限制或以任何方式限制，上文中表述的结果共同表明VSel和其他 病毒敏化剂的一个关键作用可能是降低抗病毒基因产物的转录水平。为测试该想法，我们 使用基因表达阵列并比较和对比了VSel存在或不存在下感染了VSVA 51的细胞中mRNA的特 征。用VSel或载剂预处理CT26结肠癌细胞，并随后用VSVA51(M0I 0.03)感染或用培养基模 拟感染。感染后24小时，提取RNA，并比较mRNA的表达。我们发现在这些条件下，VSVA 51感染 导致超过80种细胞基因的转录增加，所述基因包括多种已知的抗病毒基因（例如，0AS、 Μχ2)ΑΑΗΑ预处理显著钝化病毒诱导的这些基因之中很多（79%)的转录，但在选定的情况 下，所述预处理似乎还增加病毒诱导的基因转录(相对于单独的病毒，6种基因增加超过2 倍）。与增强VSVA 51复制和扩散的能力相一致的是，VSel强烈降低单独病毒感染所诱导的 超过96 %的细胞抗病毒转录本的诱导。
[0206] VSel增加 VSVA 51在体内和原代人肿瘤样品中的溶瘤活性
[0207] 因为VSel体外增强VSVA 51在癌细胞而非正常细胞中的溶瘤活性，我们试图确定 在体内和/或在新鲜移出的患者肿瘤材料中是否可观察到该水平的特异性。给Balb/C小鼠 植入耐受VSVA51的CT26结肠癌细胞系，并且在用载剂对照、VSel、载剂/VSVA51或VSel/ VSVA51处理之后，评价肿瘤的生长。虽然单独的VSel或VSVA51对肿瘤生长都没有显著作 用，但VSel和VSVA51的联合导致肿瘤进展的显著延迟。重要的是，当在存在或不存在VSel 下用具有GFP基因的VSV Δ 51处理动物时，在被处理的动物的任何正常组织中均没有可检测 到的病毒。当在VSel存在下体外感染原代人肿瘤移出物时，观察到了这种相同的特异性和 病毒增强程度。证明了这些实验的示例，其中在VSel存在或不存在下，将VSVA51-GFP添加 至结肠癌样品。虽然在该患者样品中，VSV Δ 51-GFP本身的复制较差，但在VSe 1存在下，其生 长和扩散(通过绿色荧光而可视化)显著增强。在增加量的VSel存在下测定原代人肿瘤样品 中产生的病毒滴度。如在以前肿瘤细胞系实验中所观察到一样，在多种来源的原代人肿瘤 样品中，我们发现VSel可10至100倍地增加 VSVA 51。在一个结肠直肠癌病例中，分离临近的 正常结肠组织，并且与临近的正常组织相比，VSVA 51本身在肿瘤中生长的更好。重要的是， 虽然处理带有VSel的移出物并不增加 VSV Δ 51在正常组织中的复制，但其导致VSV Δ 51在肿 瘤组织中超过100倍的生长，导致在正常和癌组织之间，复制相差大约1000倍。
[0208] 在以下实施例中，将进一步地说明本发明。 实施例
[0209] 筛选测定
[0210]为了以高通量方式鉴定病毒敏化剂，我们开发了使用96孔板的测定以量化对抗癌 细胞的溶瘤病毒的活性。起初，该测定检测对抗4T1乳腺癌细胞的VSVA 51相关的细胞毒性。 该测定使用HEPES缓冲的、无酚红的细胞培养基(Gibco?)以使背景最小化，并使与可影响 VSV生长的pH改变相关的问题最小化。对于该测定，在96孔板中接种每孔30 000个4T1细胞， 并且使所述细胞在上述培养基中过夜黏附至所述板。第二天，用1〇μΜ浓度的库化合物 (library compound)(溶于5%二甲基亚讽（dimethylsulfoxide，DMS0))预处理4小时，使用 Biomek FX液体处理机（liquid handler)添加，并随后以0.03的感染复数(Μ0Ι)的VSVA51 或对照(使用Biotek yFill添加)攻击。为每种条件重复两块板。在每块板上，包括了包含以 5 %DMS0(阴性对照）或5μΜ SAHA(阳性对照）预处理（与所述库化合物同时）的细胞的内对 照。40小时之后，从孵育器中取出板，并使其在室温下平衡2小时，并且向所述板中添加 阿尔玛蓝?试剂，并立即使用焚光读板仪（Perkin Elmer EnVision读板仪，53〇nm激发， 590发射)读取第一荧光读数。随后在室温下孵育板2小时，并读取第二荧光读数。计算第二 和第一读数之间的差异，并将其用于代谢活性的进一步计算。尽管已知读取第二和第一次 读数之间的差异会降低自发荧光化合物的干扰作用，我们发现预先平衡板温度2小时并在 加入阿尔玛蓝之后室温孵育是降低板的位置效应(position effect)的有效方式。
[0211] 鉴定病毒敏化化合物
[0212] 随后，基于标化的代谢活性值(细胞毒性)鉴定优选的化合物，其中偏好没有病毒 下的低细胞毒性和病毒存在下的高细胞毒性。值得注意的是，使用与VSVA 51联合的化合物 中观察到的细胞代谢活性与单独使用的化合物的细胞代谢活性的比值以及这两个值之间 的差异作为选择标准。还考虑B评分(B-score)用于选择命中化合物(hit compound)。具体 地说，考虑在病毒存在下表现出负的B评分但在没有病毒时表现出接近零的B评分的化合物 为潜在的病毒敏化剂。B评分标化使用双向中位数平滑(median polish)，因此考虑行/列位 置效应（Brideau et al.，J Biomol Screen.2003 Dec;8(6):634-47;其通过引用并入本 文），并阻止基于位置的选择。为此，偏好本身表现出接近零的B评分但在病毒存在下表现出 高度负的B评分(表明更大的细胞毒性）的化合物。此外，在病毒存在和不存在下获得的B评 分之间的差异被认为是鉴定在感染的相对于未感染的孔之间表现出大的活性差异之化合 物的参数（△ B评分）。最后，在命中的选择中，要考虑结果的重复。对于每个参数，基于均值 和标准差和/或基于命中率来确立严格性阈值。随后，基于4种不同权重的通过上文中描述 的不同参数计算的评分来鉴定潜在的病毒敏化剂，并且生成了具有最高1/4评分的化合物 的编制列表。
[0213]新病毒敏化化合物的验证
[0214] 使用上文中描述的方法，我们筛选了超过13500种化合物，并且鉴定了很多病毒敏 化化合物。按本文的描述进一步分析符合严格截断标准(cut-off criteria)的那些化合物 的结构相似性。在4T1细胞中，通过两种或多种以下方法，当独立的测试两次显示增强的VSV A 51扩散和溶瘤活性时，则化合物被验证:荧光显微镜检测法(病毒扩散）、考马斯蓝测定法 (细胞脱离、细胞毒性）、阿尔玛蓝测定法(代谢活性、细胞毒性)或蚀斑测定法(病毒滴度）。 在接近筛选中所使用的给定剂量范围（20μΜ至2.5μΜ之间）内进行初始测试。
[0215] 通过筛选方法鉴定的表现出高活性的一种病毒敏化剂是3,4_二氯-5-苯基-2,5-二氢呋喃-2-酮(DCPDF)。我们确证DCPDF增加 VSVA51在4Τ1乳腺癌细胞中的扩散，并且发现 其还增强VSV △ 51在CT26结肠癌细胞、786-0人肾癌细胞和U251人神经胶质母细胞瘤细胞中 的扩散(图1、2、5a)。然而，DCPDF不增强VSV △ 51在正常人GM38成纤维细胞中的扩散(图5a)。 [0216] DCPDF增加 VSVA51在多种细胞系（包括786-0、CT26和4T1)中的滴度（图4、5b、5c)。 在CT26细胞中，与对照处理的细胞相比，用DCTOF预处理增加 VSV Δ 51滴度超过1000倍（图4、 5b)。还发现DCPDF对病毒输出的作用是浓度依赖性的（图5c)。
[0217]基于Chou和Talalay (Chou和Talalay( 1977)J · Biol · Chem· 252:6438-6442，其通过 引用并入本文）的方法的等效剂量分析法（isobologram analysis)确证，当在4T1和CT26细 胞中与VSVA 51联合使用时，DCPDF导致真正的协同细胞杀伤（图6a)。这还可通过图3和6b中 的考马斯染色而被可视化。
[0218]我们还检测了 DCTOF是否可以增强其他溶瘤病毒的扩散。在B16黑色素瘤细胞以及 在4T1细胞中，我们观察到了遗传减毒处理的痘苗病毒毒株(VVdd，胸苷激酶和痘苗生长因 子基因缺失；图7a、b)增强的扩散和病毒输出(McCart et al.，2001 Cancer Res.Dec 15; 61(24) :8751-7,其通过引用并入本文）。不希望受到理论的限制或以任何方式限制，初步数 据表明，DCPDF改变细胞周期进展，其中细胞最终积聚于G1。值得注意的是，细胞周期阻滞的 动力学似乎不同于使用TSA(也阻断细胞周期于G1的HDI)所观察到的阻滞（图8a、b)。最终， 不希望受到理论的限制或以任何方式限制，DCPDF可部分通过克服IFN应答而运作，因为在 用DCPDF处理之后，以IFN保护的U251细胞对VSV Δ 51部分地被重新敏化(图9)。
[0219] 其他新病毒敏化化合物
[0220]验证了高活性的病毒敏化剂DCTOF之后，我们根据前述标准进一步地验证另一些 病毒敏化化合物。通过筛选鉴定之后，马上对化合物进行初始测试，随后，优先考虑表现出 与DCTOF类似结构的分子，所述结构基于以下特征:5个原子的呋喃环和以其他电负性原子 (例如，氮或硫)对呋喃环的氧原子的可能的替代。鉴定并验证了另一些病毒敏化化合物(见 图10a~j)，并且进一步研究其结构以确定支持病毒敏化活性的共同的基本结构特征。通过 仔细检查筛选所鉴定的化合物，我们发现多个化合物可通过上文中描述的结构相似性而分 组。
[0221 ]材料、方法和其他技术细节
[0222] 药物和化学品：用于高通量筛选的化合物是从Maybridge HitFinder、Chembridge DIVERSet、Microsource Spectrum、Prestwick、BI0M0L和Sigma L0PAC筛选收集物 (screening collection)中选出的亚类。化合物的选择基于化学多样性和非重叠。将所有 化合物以10mM溶于DMS0中。为了进一步体外测试，从Ryan Scientific(Mt·Pleasant，SC， USA)获得VSel (也称为3，4-二氯-5-苯基-2，5-二氢呋喃-2-酮或DCPDF)，并以lOmM将其溶于 DMS0。为了体内使用，以0.4mg/50y 1将VSe 1溶于新制的30 %乙醇、5 % DMS0 (PBS中）。从 Exclusive Chemistry (Obninsk，Russia)获得 SAHA，并且也将其以 10mM 溶于 DMS0。二者均存 储于-20°C。使用Intron A(Shering)(以10 X 106IU/ml的储存浓度存储于40C)进行IFNa处 理。
[0223] 细胞系：以下细胞系购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection) :4T1 (小鼠乳腺腺癌）、B16(小鼠黑色素瘤）、786-0(人肾癌）、U251(人神经胶质 瘤）、GM38(正常的人成纤维细胞）、HEK293T(人胚胎肾）、U20S(人骨肉瘤）和Vero(猴肾细 胞）。除了GM38之外，所有细胞系均培养在补充了 10%胎牛血清（0&1^6以4丨〇1^(3〇1^， Canada)的HyQ高糖Dulbecco's modifed Eagle medium(DMEM)培养基中（HyClonehGIVBS细 胞生长在补充了20%胎牛血清(Gibco)的DMEM中。所有细胞系均在37度下孵育于5%⑶2的 潮湿培养箱中。
[0224] 病毒:在整个研究中，使用VSV的Indiana血清型（突变或野生型），并且其在Vero细 胞中繁殖。VSVA51是野生型VSV Indiana的天然的、干扰素诱导的突变，而表达RFP或GFP的 VSV Δ 51是VSV Δ 51的重组衍生物（49)。通过0 · 2μηι Steritop滤器(Millipore，Billerica， ΜΑ)和在用roS(HyCl〇ne，L〇gan，UT)重悬之前以30,000g离心来从细胞培养物的上清液中纯 化病毒颗粒。对于高通量筛选，添加30%蔗糖以增加病毒的稳定性。对于体内研究，用5~ 50 % Optiprep? (Sigma)梯度进一步纯化病毒。通过与VVdd-GFP同源重组而获得表达荧 光Cherry蛋白的双缺失痘苗病毒(VVdd)，并将其在U20S细胞中繁殖。
[0225] 高通量筛选:在96孔板中HEPES缓冲的、无酚红的DMEM(Gibco)中接种4T1细胞，并 使其过夜黏附。第二天，以使用Biomek FX液体处理机（Beckman Coulter，Fullerton，CA， USA)添加的1 ΟμΜ浓度的库化合物预处理9 5 %汇合的细胞4小时，并随后以使用yFi 11液体处 理机0丨(^61^丨11〇〇81^，￥1'，1^4)添加的]\?)1为〇.〇325的￥3￥&51或对照攻击所述细胞。为每 种条件重复两块板。在每块板上，包括了由以DMS0(阴性对照)预处理的细胞(与库化合物同 时）构成的内对照。40小时之后，用阿尔.瑪.蓝⑩孵育板，并使用EnVision读板仪(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)评价荧光发射率。在病毒存在和不存在下测定每种药物的细胞毒 性，其定义如下：VSVA 51(VSV)存在下的细胞毒性=药物存在下的荧光率+VSVA 51除以 DMS0+VSV Δ 51对照(每板8个)的平均荧光率。VSV Δ 51 (对照)不存在下的细胞毒性=药物存 在下的荧光率(但无病毒)除以DMS0对照(无病毒，每板8个)的平均荧光率。通过比较感染的 和模拟感染的板上的DMS0对照来评价单独病毒诱导的细胞杀伤，并且其低于10%。将两个 重复的平均Log(VSV/对照)值用作选择命中的参数，其中-0.3是截断值。在选择中，还考虑 两个重复之间Log(VSV/对照)值的重现性。
[0226] 病毒滴度：在特定的时间点收集来自每个治疗条件的上清液。随后在无血清的 DMEM中进行一系列稀释，并且将500μ1的每个稀释应用于Vero细胞汇合的单层45分钟。随 后，用DMEM-10% FBS中0.5%的琼脂糖覆盖该板，并使蚀斑生长24小时。随后，将卡若氏固 定剂(Carnoy fixative)(甲醇：乙酸为3:1)直接应用于所述覆盖的上方5分钟。用|产轻轻抬 离所述覆盖，并用0.5%的考马斯蓝染色经固定的单层30分钟，随后计数蚀斑。使用DMEM-10% FBS中48h的1.5%羧基甲基纤维素，用U20S单层测定VVDD样品的滴度。除去所述覆盖， 并用0.5 %的考马斯蓝染色该单层30分钟，随后计数蚀斑。
[0227] 联合指数的评价:在96孔板中，每孔接种25 000个4T1或CT26细胞，并使其过夜黏 附。次日，用系列稀释的Vsel(200yM至1.5μΜ，1:2稀释梯度)预处理4小时，随后用系列稀释 的VSVA 51(100000PFU至780PFU)感染，保持VSVA 51和VSel联用的固定比例（500PFU对1μ Μ)。4811之后，使用阿尔玛蓝试剂评价细胞毒性。根据Chou和Talalay的方法（Chou and Talalay(1977)J.Biol.Chem .252:6438-6442)，使用Calcusyn Software (Bios oft， Ferguson M0，USA)计算联合指数(Cl) 〇
[0228] 报道基因测定:在24孔皿中，以1.3X105个细胞/孔接种HEK 293T细胞。次日，用前 述的 ISRE 驱动的萤光素酶报道质粒(Lai，F et al. (2008). J Virol Methods 153:276-279)和CMV驱动的β-半乳糖苷酶对照质粒共转染细胞。转染后6小时，以VSel处理细胞或用 载剂模拟处理细胞。接受VSel大约20小时之后，用IFN-α处理细胞并完全更换培养基。次日， 裂解细胞，并使用BD Monolight试剂盒（Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA)测量 萤光素酶。使用发光β-半乳糖苷酶试剂盒(<^1〇]^(311，]\1〇111^；[1^6￥^，1^)测量0-半乳糖 苷酶的活性。
[0229] HDAC酶活性测定：在VSel 20μΜ或TSA 20μΜ存在下，?ΚθΒ(^?οηΒ?ο1(^7(：〇Γρ· (Malvern，PA，USA)使用 50μΜ 来自 ρ53残基379 ~382(对于 HDAC 1 ~7和9-11 为RHKKAc或对于 HDAC8为RHKAcKAc)的荧光肽，测量重组HDAC 1至11的活性。将HDAC活性与以DMS0 (载剂)处 理的对照相比较，并表示为对照HDAC活性的百分比。所有的条件都以两个重复进行测试。
[0230] 微阵列：在100mm培养皿(petris)中，以1.5 X 106的密度接种CT26细胞，并使其过 夜黏附。次日，用DMS0、20yM VSel或5μΜ SAHA处理细胞。4小时之后，以0.03的Μ0Ι添加 VSVA 51(或对照培养基）。感染后24小时，使用橡胶刮刀在少量PBS中收集细胞。随后，使用Qiagen QiaShredder柱和Qiagen Rneasy提取试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)，将细胞沉淀用于 总RNA的提取。将合并的两个重复的样品RNA用于随后微阵列上的的杂交。根据制造商的说 明书标记RNA和将其杂交到Affymetrix小鼠基因1 ·0 ST阵列上之前，使用Agilent 2100 Bioanalyzer (Santa Clara，CA，USA)来确证RNA的品质。从数据集中除去低信号的基因 (DMSO处理的、模拟感染的对照中<50)。将剩余基因的表达标化至每个阵列的平均总体信 号。随后，为与模拟感染、DMS0处理的对照相关的每个基因计算基因表达改变的倍数。使用 与对照相关的基因表达的2倍改变作为截断来选择处理所干扰的基因。使用Microsoft Excel进行分析。
[0231] 动物肿瘤模型：在6周龄的雌性Balb/c小鼠的后胁中，通过注射3X105个悬于100μ 1 PBS耐VSVA 51的CT26细胞而皮下建立同基因的结肠癌肿瘤。接种后11天时，肿瘤已经达 到约220mm3的平均大小，用重悬于30%乙醇、5%01^0、65%?83(或载剂对照）中0.411^剂量 的VSel腹膜内施用来处理小鼠。第一次VSel给药之后4小时，肿瘤内引入VSVA51(1X 108pfu)。随后，在植入(0.4mg/注射/小鼠）后第13天和第15天再次施用VSel(或载剂）。每2 ~3天使用电子卡尺测量肿瘤大小。计算肿瘤体积为=(长度X宽度 2)/2。为每只小鼠计算 每个时间点相对于第11天测量的初始肿瘤大小的相对肿瘤大小。使用AN0VA来评价每个时 间点时所观察到的差异的统计学显著性。
[0232] 原代组织标本的处理和加工：从同意的进行肿瘤切除的患者中获得原代组织标 本。在手术切除后4 8小时内加工所有的组织。使用K r u m d i e c k组织切片机（A1 a b a m a research and development，Munford，AL，USA)获得300μηι的组织切片，并且将其接种在补 充了 10% FBS的DMEM中。在指定的处理条件之后，通过荧光显微镜检测法将样品可视化。随 后称重，并使用匀浆机(Kinematica AG-P⑶-11)在lml PBS中匀浆。在无血清培养基中制备 组织匀浆液的系列稀释，并通过标准的蚀斑测定法来定量病毒滴度。
[0233] 实时PCR:根据制造商的说明书（Invitrogen，ON，Canada)，使用Superscript第一 链合成系统（随机六聚体法），用2yg RNA合成cDNA。按照推荐使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒（Qiagen，0N，Canada)。使用Rotor-gene RG_3〇0(Corbett Research，Australia) 进行实时PCR反应。使用Rotor-gene软件确定最适阈值和反应效率。每个引物的溶解曲线表 现为单峰，表明特异性的扩增，这也通过琼脂糖凝胶而确证。在之前为每个基因确定的最适 阈值下，使用Rotor-gene软件测定Ct值。计算相对于GAPDH的基因表达。为每个基因计算相 对于DMS0处理的对照的诱导倍数。引物是使用Primer 3 v 4.0设计的。
[0234] 所有的引文均通过引用并入本文。
[0235] 参照一个或多个实施方案描述了本发明。然而，对于本领域技术人员来说显而易 见的是，只要不离开权利要求书中所定义的本发明的范围，可进行多种改变和修改。
[0236] 参考文献
[0237] l.Adusumilli PS,Chan MK,Chun YS,Hezel M,Chou TC,Rusch Vff et al. (2006).Cisplatin-induced GADD34 upregulation potentiates oncolytic viral therapy in the treatment of malignant pleural mesothelioma.Cancer Biol Ther； 5:48-53.
[0238] 2.Ahmed,M.,S.D.Cramer,and D.S.Lyles,Sensitivity of prostate tumors to wild type and M protein mutant vesicular stomatitis viruses.Virology,2004.330 (l)：p.34-49.
[0239] 3.Bennett JJ,Adusumilli P,Petrowsky H,Burt BM,Roberts G,Delman KA et al.(2004).Upregulation of GADD34 mediates the synergistic anticancer activity of mitomycin C and a gamma134.5 deleted oncolytic herpes virus(G207).FASEB J； 18:1001-1003.
[0240] 4.Brideau，C.，B.Gunter，B.Pikounis，and A·Liaw，Improved statistical methods for hit selection in high-throughput screening.J Biomol Screen?2003.8 (6)：p.634-47.
[0241] 5.Chalikonda S，Kivlen MH，07Malley ME，Eric Dong XD，McCart JA，Gorry MC et al.(2008).Oncolytic virotherapy for ovarian carcinomatosis using a replication-selective vaccinia virus armed with a yeast cytosine deaminase gene.Cancer Gene Ther；15：115-125.
[0242] 6. Chang，H.M.，M.Paulson，M.Holko，C.M.Rice，B.R.Wil1iams，I.Marie，and D.E.Levy ?Induction of interferon-stimulated gene expression and antiviral responses require protein deacetylase activity.proc Natl Acad Sci USA， 2004.101(26)：p.9578-83.
[0243] 7.Chen G，Zhou J，Gao Q，Huang X，Li K，Zhuang L et al·(2006).Oncolytic adenovirus-mediated transfer of the antisense chk2 selectively inhibits tumor growth in vitro and in vivo.Cancer Gene Ther;13:930-939.
[0244] 8.Cheong SC，Wang Y，Meng JH，Hill R，Sweeney K，Kirn D et al · (2008).E1A-expressing adenoviral E3B mutants act synergistically with chemotherapeutics in immunocompetent tumor models.Cancer Gene Ther；15:40-50.
[0245] 9 · Chou，T · C · and P · Talaly，A simple generalized equation for the analysis of multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetic systems.J Biol Chem?1977.252(18)：p.6438-42.
[0246] 10·Ebert，0·，S·Harbaran，K·Shinozaki，and S.L.ffoo?Systemic therapy of experimental breast cancer metastases by mutant vesicular stomatitis virus in immune-competent mice.Cancer Gene Ther?2005.12(4)：p.350-8.
[0247] 11.Foloppe J，Kintz J，Futin N，Findeli A，Cordier P，Schlesinger Y et al· (2008).Targeted delivery of a suicide gene to human colorectal tumors by a conditionally replicating vaccinia virus.Gene Ther;15:1361-1371·
[0248] 12.Freytag S0?Barton KN?Brown SL?Narra V?Zhang Y?Tyson D et al. (2007).Replicationcompetent adenovirus-mediated suicide gene therapy with radiation in a preclinical model of pancreatic cancer.Mol Ther；15：1600-1606.
[0249] 13.Fukuda K，Abei M，Ugai H，Kawashima R，Seo E，Wakayama M et al·(2009) ?E1A，E1B doublerestricted replicative adenovirus at low dose greatly augments tumor-specific suicide gene therapy for gallbladder cancer.Cancer Gene Ther； 16:126-136.
[0250] 14.Galanis E，0kuno SH，Nascimento AG，Lewis BD，Lee RA，01iveira AM et al.(2005).Phase I-II trial of 0NYX-015 in combination with MAP chemotherapy in patients with advanced sarcomas.Gene Ther;12:437-445.
[0251] 15.Gao Q，Zhou J，Huang X，Chen G，Ye F，Lu Y et al·(2006)·Selective targeting of checkpoint kinnase 1 in tumor cells with a novel potent oncolytic adenovirus.Mol Ther;13:928-937.
[0252] 16.Graat HC，Witlox MA，Schagen FH，Kaspers GJ，Helder MN，Bras J et al· (2006) .Different suusceptibility of osteosarcoma cell lines and primary cells to treatment with oncolytic adenovirus and doxorubicin or cisplatin.Br J Cancer；94:1837-1844.
[0253] 17.Hsieh JL，Lee CH，Teo ML，Lin YJ，Huang YS，Wu CL et al·(2009) .Transthyretin-driven oncolytic adenovirus suppresses tumor growth in orthotopic and ascites models of hepatocellular carcinoma.Cancer Sci;100:537- 545.
[0254] 18.Hsu KF，Wu CL，Huang SC，Hsieh JL，Huang YS，Chen YF et al.(2008) .Conditionally replicating ElB-deleted adenovirus driven by the squamous cell carcinoma antigen 2 promoter for uterine cervical cancer therapy.Cancer Gene Ther；15：526-534.
[0255] 19.Ikeda K，Ichikawa T，Wakimoto H，Silver JS，Deisboeck TS，Finkelstein D et al.(1999).Oncolytic virus therapy of multiple tumors in the brain requires suppression of innate and elicited antiviral responses.Nat Med 5:881-887.
[0256] 20·Ikeda K，Wakimoto H，Ichikawa T，Jhung S，Hochberg FH，Louis DN et al · (2000). Complement depletion facilitates the infection of multiple brain tumors by an intravascular，rep1icationconditional herpes simplex virus mutant.J Virol；74：4765-4775.
[0257] 21.Kambara H，Saeki Y?Chiocca EA(2005).Cyclophosphamide allows for in vivo dose reduction of a potent oncolytic virus.Cancer Res；65：11255-11258.
[0258] 22.Kasuya H，Nishiyama Y，Nomoto S，Goshima F，Takeda S，Watanabe I et al· (2007) . Suitability of a US3-inactivated HSV mutant(LlBRl).as an oncolytic virus for pancreatic cancer therapy. Cancer Gene Ther;14:533-542.
[0259] 23.Kim EJ，Yoo JY，Choi YH，Ahn KJ，Lee JD，Yun CO et al.(2008).Imaging of viral thymidine kinase gene expression by replicating oncolytic adenovirus and prediction of therapeutic efficacy.Yonsei Med J；49：811-818.
[0260] 24.Kottke T，Thompson J，Diaz RM，Pulido J，Willmon C，Coffey M et al· (2009). Improved Systemic Delivery of Oncolytic Reovirus to Established Tumors Using Preconditioning with Cyclophosphamide-Mediated Treg Modulation and Interleukin-2.Clin Cancer Res；15：561-569.
[0261] 25.Kramm CM，Rainov NG，Sena_Esteves M，Barnett FH，Chase M，Herrlinger U et al.(1996).Longterm survival in a rodent model of disseminated brain tumors by combined intrathecal delivery of herpes vectors and ganciclovir treatment.Hum Gene Ther；7：1989-1994.
[0262] 26.Kurozumi K，Hardcastle J，Thakur R，Shroll J，Nowicki M，0tsuki A et al.(2008).Oncolytic HSV-1 infection of tumors induces angiogenesis and upregulates CYR61.Mol Ther;16:1382-1391.
[0263] 27.Kurozumi K，Hardcastle J，Thakur R，Yang M，Christoforidis G，Fulci G et al.(2007).Effect of tumor microenvironment modulation on the efficacy of oncolytic virus therapy.J Natl Cancer Inst；99：1768-1781.
[0264] 28.Lun XQJang JN，Tang N，Deng H，Bell JC，Stojdl DF et al.(2009) .Efficacy of systemically administered oncolytic vaccinia virotherapy for malignant gliomas is enhanced by combination therapy with rapamycin or cyclophosphamide.Clin Cancer Res；15：2777-2788.
[0265] 29·Lun XQ，Zhou H，Alain T，Sun B，Wang L，Barrett JW et al · (2007) .Targeting human medulloblastoma：oncolytic virotherapy with myxoma virus is enhanced by rapamycin.Cancer Res；67:8818-8827.
[0266] 30·Lun，X·，D·L·Senger，T·Alain，A·Oprea，K·Parato，D·Stojdl，B·Lichty， A.Power?R.N.Johnston?M.Hamilton?I.Parney?J.C.Bell ?and P.A.Forsyth?Effects of intravenously administered recombinant vesicular stomatitis virus (VSV (deltaM51))on multifocal and invasive gliomas.J Natl Cancer Inst,2006.98(21): p.1546-57.
[0267] 31.Mace AT?Harrow SJ?Ganly I?Brown SM(2007).Cytotoxic effects of the oncolytic herpes simplex virus HSV 1716 alone and in combination with cisplatin in head and neck squamous cell carcinoma.Acta Otolaryngol；127：880-887.
[0268] 32.Mai，A.，S·Valente，A.Nebbioso，S·Simeoni，R.Ragno，S.Massa，G·Brosch， F.De Bel1is，F·Manzo，and L.Altucci ?New pyrrole-based histone deacetylase inhibitors：binding mode ?enzyme-and cell-based investigations .Int J Biochem Cell Biol?2009.41(l)：p.235-47.
[0269] 33.McCart JA，Puhlmann M，Lee J，Hu Y，Libutti SK，Alexander HR et al· (2000).Complex interactions between the replicating oncolytic effect and the enzyme/prodrug effect of vaccinia mediated tumor regression.Gene Ther；7：1217-1223.
[0270] 34.Monneret?C.?Histone deacetylase inhibitors.Eur J Med Chem?2005.40 (l)：p.l-13.
[0271] 35.Mullerad M，Bochner BH，Adusumilli PS，Bhargava A，Kikuchi E，Hui_Ni C et al.(2005).Herpes simplex virus based gene therapy enhances the efficacy of mitomycin C for the treatment of human bladder transitional cell carcinoma.J Urol；174：741-746.
[0272] 36.NawaA，NozawaN，GoshimaF，NagasakaT，KikkawaF，NiwaYetal. (2003). Oncolytic viral therapy for human ovarian cancer using a novel replication-competent herpes simp lex virus type I mutant in a mouse model.Gynecol Oncol;91:81-88.
[0273] 37·Nguyen，T·L·，H·Abdelbary，M.Arguello，C.Breitbach，S.Leveille， J.S.Diallo?A.Yasmeen?T.A.Bismar?D.Kirn ?T.Falls?V.E.Snoulten?B.C.Vanderhyden ? J.fferier?H.Atkins?M.J.Vaha-Koskela?D.F.Stojdl ?J.C.Bell?and J.Hiscott?Chemical targeting of the innate antiviral response by histone deacetylase inhibitors renders refractory cancers sensitive to viral oncolysis.Proc Natl Acad Sci USA，2008.105(39):p.14981-6.
[0274] 38.Pan Q，Liu B，Liu J，Cai R，Wang Y，Qian C(2007).Synergistic induction of tumor cell death by combining cisplatin with an oncolytic adenovirus carrying TRAIL.Mol Cell Biochem；304：315-323.
[0275] 39.Pan Qff?Zhong SY?Liu BS?Liu J?Cai R?ffang YG et al.(2007).Enhanced sensitivity of hepatocellular carcinoma cells to chemotherapy with a Smac- armed oncolytic adenovirus.Acta Pharmacol Sin；28：1996-2004.
[0276] 40·Parato，K·A.，D·Senger，P.A.Forsyth，and J.C.Bell，Recent progress in the battle between oncolytic viruses and tumors.Nat Rev Cancer ?2005.5(12)： p.965-76.
[0277] 41.Pawlik TM?Nakamura H?Mullen JT?Kasuya H?Yoon SS?Chandrasekhar S et al.(2002).Prodrug bioactivation and oncolysis of diffuse liver metastases by a herpes simplex virus 1 mutant that expresses the CYP2B1 transgene.Cancer； 95:1171-1181.
[0278] 42.Qiao J，Wang H，Kottke T，White C，Twigger K，Diaz RM et al·(2008) .Cyclophosphamide Facilitates Antitumor Efficacy against Subcutaneous Tumors following Intravenous Delivery of Reovirus.Clin Cancer Res；14：259-269.
[0279] 43.Reddy，P.S.，K.D.Burroughs，L.M.Hales，S.Ganesh，B.H.Jones， N.Idamakanti ?C.Hay ?S.S.Li ?K.L.Skele ?A.J.Vasko?J.Yang?D.N.ffatkins ?C.M.Rudin? and P.L.Hallenbeck?Seneca Valley virus?a systemically deliverable oncolytic picornavirus，and the treatment of neuroendocrine cancers.J Natl Cancer Inst， 2007.99(21)：p.1623-33.
[0280] 44.Ryan PC，Jakubczak JL，Stewart DA，Hawkins LK，Cheng C，Clarke LM et al.(2004).Antitumor efficacy and tumor-selective replication with a single intravenous injection of 0AS403?an oncolytic adenovirus dependent on two prevalent alterations in human cancer.Cancer Gene Ther；11:555-569.
[0281] 45·Sieben M，Herzer K，Zeidler M，Heinrichs V，Leuchs B，Schuler M et al. (2008).Killing of p53_ deficient hepatoma cells by parvovirus H_1 and chemotherapeutics requires promyelocyt ic leukemia protein .ffor1d J Gastroenterol；14:3819-3828.
[0282] 46·Stanford MM，Barrett JW，Nazarian SH，Werden S，McFadden G(2007) .Oncolytic virotherapy synergism with signaling inhibitors：Rapamycin increases myxoma virus tropism for human tumor cells.J Virol；81：1251-1260.
[0283] 47.Stanford MM，Shaban M，Barrett JW，Werden SJ，Gilbert PA，Bondy_Denomy J et al.(2008).Myxoma virus oncolysis of primary and metastatic B16F10 mouse tumors in vivo.Mol Ther 16:52-59.
[0284] 48.Stojdl，D.F.，B.Lichty，S.Knowles，R.Marius，H.Atkins，N.Sonenberg，and J.C.Bell ?Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus.Nat Med?2000.6(7)：p.821-5.
[0285] 49.Stojdl，D.F.，B.D.Lichty，B.R. tenOever，J · M · Paterson，A · T · Power， S·Knowles，R·Marius，J·Reynard，L·Poliquin，H·Atkins，E·G·Brown，R·K·Durbin， J.E.Durbin?J.Hiscott?and J.C.Bell?VSV strains with defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents. Cancer Cell?2003.4(4)：p.263-75.
[0286] 50.Sung CK?Choi B?ffanna G?Genden EM?ffoo SL?Shin EJ(2008).Combined VSV oncolytic virus and chemotherapy for squamous cell carcinoma.Laryngoscope； 118:237-242.
[0287] 51.Taneja?S.?J.MacGregor ?S.Markus?S.Ha?and I.Mohr，Enhanced antitumor efficacy of a herpes simplex virus mutant isolated by genetic selection in cancer cells.Proc Natl Acad Sci USA?2001.98(15)：p.8804-8.
[0288] 52.Thomas M，Spencer JF，Toth K，Sagartz JE，Phillips NJ，Wold WS(2008) .Immunosuppression enhances oncolytic adenovirus replication and antitumor efficacy in the Syrian hamster model.Mol Ther；16：1665-1673.
[0289] 53·Tomicic MT，Thust R，Kaina B(2002).Ganciclovir-induced apoptosis in HSV-1 thymidine kinase expressing cells：critical role of DNA breaks ?Bcl~2 decline and caspase-9 activation.Oncogene；21：2141-2153.
[0290] 54.Toyoizumi T，Mick R，Abbas AE，Kang EH，Kaiser LR，Molnar_Kimber KL (1999).Combined therapy with chemotherapeutic agents and herpes simplex virus type 1 ICP34.5 mutant(HSV-1716). in human non-small cell lung cancer.Hum Gene Ther；10：3013-3029.
[0291] 55.Tumilasci VF，01iere S，Nguyen TL，Shamy A，Bell J，Hiscott J(2008) .Targeting the apoptotic pathway with BCL-2 inhibitors sensitizes primary chronic lymphocytic leukemia cells to vesicular stomatitis virus-induced oncolysis.J Virol；82：8487-8489.
[0292] 56.Ungerechts G，Springfeld C，Frenzke ME，Lampe J，Parker WB，Sorscher EJ et al.(2007).An immunocompetent murine model for oncolysis with an armed and targeted measles virus.Mol Ther；15：1991-1997.
[0293] 57.Yoon AR，Kim JH，Lee YS，Kim H，Yoo JY，Sohn JH et al.(2006).Markedly enhanced cytolysis by ElB-19kD_deleted oncolytic adenovirus in combination with cisplatin.Hum Gene Ther；17:379-390.
[0294] 58.Yu DC，Chen Y，Dilley J，Li Y，EmbryM，Zhang H et al.(2001).Antitumor synergy of CV787，a prostate cancer-specific adenovirus，and paditaxel and docetaxel.Cancer Res；61:517-525.
[0295] 59.Yu YA，Galanis C，Woo Y，Chen N，Zhang Q，Fong Y et al.(2009) .Regression of human pancreatic tumor xenografts in mice after a single systemic injection of recombinant vaccinia virus GLV-lh68.Mol Cancer Ther；8： 141-151.
[0296] 60·Zhang J，Ramesh N，Chen Y，Li Y，Dilley J，Working P et al·(2002) ?Identification of human uroplakin II promoter and its use in the construction of CG8840，a urothelium-specific adenovirus variant that eliminates established bladder tumors in combination with docetaxel.Cancer Res；62：3743-3750.
[0297] 61 .Zhang NH，Song LB，Wu XJ，Li RP，Zeng MS，Zhu XF et al · (2008) .Proteasome inhibitor MG-132 modifies coxsackie and adenovirus receptor expression in colon cancer cell line lovo.Cell Cycle；7:925-933.
[0298] 62.Zhou J，Gao Q，Chen G，Huang X，Lu Y，Li K et al·(2005).Novel oncolytic adenovirus selectively targets tumor-associated polo-like kinase 1 and tumor cell viability.Clin Cancer Res；11:8431-8440.
[0299] 以下内容对应于本申请母案的原始权利要求书。
[0300] 1.下式的化合物
[0302] 其N-氧化物、药学上可接受的加成盐、季胺或立体化学异构体形式，其中：
[0303] A是包含1~4个杂原子和1或2个双键的5元杂环，所述杂原子选自0、N或S;
[0304] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0305] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0306] R3不存在，或是、H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基，和
[0307] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0308] 2.项1的化合物，其中A是
[0310] 父:是~順或S;
[0311] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0312] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0313] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基，和
[0314] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0315] 3.项1的化合物，其表示为
[0317] 其中，
[0318] 父丄是^順或S;
[0319] X2、X3和X4独立地是C或N;
[0320] X5是C;
[0321] R1是H、氧代、烷氧基羰基、肼基羰基烷基或氨基；
[0322] R2不存在，或是烷基、卤素、羧基、杂芳基羰基氨基或羟基；
[0323] R3不存在，或是H、烷基、卤素或杂环基氨基磺酰基；
[0324] R4是H、烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基；
[0325] 其中原子X2和X3之间的键是单键或双键；
[0326] 其中原子Χ3和Χ4之间的键是单键或双键；
[0327] 其中原子Χ4和Χ5之间的键是单键或双键；
[0328] 其中原子Χ5和Xi之间的键是单键或双键；
[0329] 其中当原子X2和X3之间的键以及X4和X5之间的键各自是单键时，原子X 3和X4之间的 键是双键，原子χ5和Xi之间的键是单键，χ2是C，并且R1是氧代;或者
[0330] 其中当原子Χ2和Χ3之间的键以及Χ4和χ5之间的键各自是单键时，原子χ 3和Χ4之间的 键是双键，原子χ5和间的键是双键，并且乂:是?^，或者
[0331] 其中当原子X2和X3之间的键以及X4和x5之间的键各自是双键时，原子x 3和X4之间的 键是单键，并且原子χ5和Xi之间的键是单键。
[0332] 4.项3的化合物，其表示为
[0334] 其中：
[0335] 父丨是~順或S;
[0336] R2是烷基、卤素、羧基或羟基；
[0337] R3是烷基或卤素，和
[0338] R4是烷基、未取代的芳基或以1~3个卤素取代的芳基。
[0339] 5.项1的化合物，其选自：3,4_二氯-5-苯基_2,5_二氢呋喃-2-酮、2-苯基-1Η-咪 唑-4-羧酸1.5水合物、3-[5-(2,3_二氯苯基)-2Η-1，2,3,4-四唑-2-基]丙酰肼、3,5_二甲 基-4- {[ (2-氧代-3-氮杂环庚烷基)氨基]磺酰基} 1H-吡咯-2-羧酸乙酯、2-氨基-5-苯基-3-噻吩羧酸、3-[(喹啉-6-基羰基)氨基]噻吩-2-羧酸甲酯、5-(2-氯-6-氟苯基)-3-羟基-4-甲 基-2，5-二氢呋喃-2-酮和5-( 2，6-二氯苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮。
[0340] 6.下式的化合物
[0342] 其中，
[0343] X是 0或 S;
[0344] R5是羟基烷基、杂芳基、未取代的芳基、以1或多个选自烷基和卤素的取代基取代 的芳基、杂环基或苯并二氧杂环烷基烷基;和
[0345] R6是氨基、芳基或以1或多个选自烷基和卤素的取代基取代的芳基。
[0346] 7.项6的化合物，其中所述化合物选自：N_( 3,4-二甲基苯基）1-(2-吡啶基）硫 脈、Nl_(2，6_二乙基苯基)餅-1-硫代甲酰胺、N-(2_轻乙基)-1/ _(2_甲基苯基)硫脈、Nl-(2_ 氯-6-甲基苯基)肼-1-硫代甲酰胺和N-(4-氯苯基)-Y-(2,3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己-2-基甲基)脲。
[0347] 8.选自以下的化合物:3，4-二氯-5-苯基-2，5-二氢呋喃-2-酮、2-苯基-ΙΗ-咪唑-4_羧酸1.5水合物、3- [ 5- (2，3-二氯苯基)-2H-1，2，3，4-四唑-2-基]丙酰肼、3，5-二甲基Ι-?： [(2-氧代-3-氮杂环庚烷基) 氨基] 磺酰基} 1H-吡咯-2-羧酸 乙酯、 2-氨基-5-苯基-3-噻吩 羧酸、3-[(喹啉-6-基羰基)氨基]噻吩-2-羧酸甲酯、5-( 2-氯-6-氟苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮和5-(2，6-二氯苯基)-3-羟基-4-甲基-2，5-二氢呋喃-2-酮、Ν-( 3，4-二 甲基苯基）_(2_吡啶基）硫脈、Nl_(2，6-二乙基苯基）餅-1-硫代甲酰胺、Ν_(2-羟基乙 基)-^-(2-甲基苯基)硫脲、Nl-(2-氯-6-甲基苯基)肼-1-硫代甲酰胺、Ν-(4-氯苯基)-^-(2,3_二氢-1，4-苯并二氧杂环己-2-基甲基)脲、4-(苄氧基)-2-甲基-1-硝基苯、1-{4-[(2_ 甲基喹啉-4-基)氨基]苯基}乙-1-酮、Nl-(1，2,3，10-四甲氧基-9-氧代_5,6,7,9_四氢苯并 [a]庚搭稀-7-基）乙酰胺、N-[4_(二甲基氨基)亚苄基]氨基甲腙酸硫甲酯、N-(4_氯苯基)-(二甲基氨基）甲酰亚胺硫甲酯氢碘酸盐、4人二氢-4M5-甲氧基苯基)螺[2H-1-苯并噻 喃吡唑]-4-酮、1H-苯并[d]咪唑-2-硫醇、N-(2-呋喃基亚甲基)-(4-{[(2_ 呋喃基亚甲基)氨基]甲基}环己基）甲胺;2-[4-(二乙氧基甲基)亚苄基]丙二腈;2-(环丙基 幾基) _3_(3_苯氧基_2_噻吩基)丙稀臆;-(3,5-二氯苯基)-2,4-二氣苯甲酰餅;1〇-(羟基 亚甲基)菲-9(10H)_酮;Nl-(2,5-二氟苯基)-4-({[4-(三氟甲基)苯基]磺酰基}氨基)苯-1-磺酰胺;N-[4-(4-氯苯基)-2,5_二氧代哌嗪基]-2-(2,3-二氢-lH-吲哚-1-基）乙酰胺、4-{[(4-{[(3-羧基丙烯酰基)氨基]甲基}环己基）甲基]氨基}-4-氧代-2-丁烯酸;5-氧代-3-苯基-5-{4-[3-(三氟甲基)-1Η-吡唑-1-基]苯胺基}戊酸、Nl-(4-氯苯基)-2-({4-甲基-5-[l-甲基-2-(甲基硫代)-lH-咪唑-5-基]-4H-l，2,4-三唑-3-基}硫代）乙酰胺、6-[2-(4-甲 基苯基)-2-氧代乙基]-3-苯基_2,5_二氢-1，2,4-三嗪-5-酮;Nl-[2-(叔丁基)-7-甲基-5-(三氟甲基)吡唑并[l，5-a]嘧啶-3-基]乙酰胺;4-(2,3_二氢-1H-茚-5-基)-6-(三氟甲基） 嘧啶-2-胺；1_( 2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-基磺酰基)-4-哌啶羧酸乙酯、2，3-二苯基环丙-2- 烯-1-酮、1-环十二烷基-1H-吡咯-2，5-二酮、1-(4-甲基苯基)-2，5-二氢-1H-吡咯-2，5-二 酮、2-[(4_苯氧基苯胺基）甲基]异二氢吲哚-1，3-二酮、2-{[1-(3_氯-4-甲基苯基)-2,5_二 氧代四氢-1H-吡咯-3-基]硫代}苯甲酸、1-(1，3_苯并二氧杂环戊-5-基甲基)-2,5_二氢-1H-吡咯_2,5_二酮、4-氯-N-[3-氯-2-(异丙基硫代)苯基]苯甲酰胺、N-({5-[({2-[(2-呋 喃基甲基)硫代]乙基}氨基)磺酰基]-2-噻吩基}甲基)苯甲酰胺、帕苯达唑、甲硫苯唑、秋水 仙素、长春瑞滨碱、4-氨基-2-苯胺基-5-硝基噻吩-3-羧酸乙酯、2-[二（甲基硫代)亚甲基] 丙二腈、草酸N-(1H-吲哚-3-基甲基)-N-甲基-2-苯基乙胺、3-(2-呋喃基)-N-(4,5,6,7-四 氢-1，3-苯并噻唑-2-基）丙烯酰胺、阿苯达唑、草酸2-苯基-4-喹啉胺、紫杉醇、诺考达唑、 (2,5-二甲氧基苯基）[(2-甲氧基-1-萘基）甲基]胺、08卩0卩、8890、1^把厶、1?把厶和1^33。
[0348] 9 .项8的化合物，其中所述化合物是3，4-二氯-5-苯基-2，5-二氢呋喃-2-酮 (DCPDF)〇
[0349] 10.-种组合物，其包含项8的化合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0350] 11. -种组合物，其包含项8的化合物和以下的一种或更多种:a)病毒、遗传修饰的 病毒、减毒的病毒或溶瘤病毒，b) -种或更多种癌细胞，c)载体、稀释剂或赋形剂，d)药学上 可接受的载体、稀释剂或赋形剂，e)非癌细胞;f)细胞培养基;g)-种或更多种癌治疗剂;或 a)~g)的任何组合。
[0351] 12.-种试剂盒，其包含项8的化合物和a)病毒、遗传修饰的病毒、减毒的病毒或溶 瘤病毒，b)-种或更多种癌细胞，c)药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，d)非癌细胞;e) 细胞培养基;f)一种或更多种癌治疗剂，g)细胞培养板或多孔皿;h)向细胞、培养基或对象 递送病毒敏化剂的设备；i)使用所述病毒敏化剂的说明书，j)载体稀释剂或赋形剂，或a)~ j)的任何组合。
[0352] 13.增强病毒在细胞中扩散和/或滴度的方法，所述方法包括在病毒之前、之后或 同时将项8的化合物施用至所述细胞，并培养所述病毒和细胞以增强所述病毒在所述细胞 中的扩散和/或滴度。
[0353] 14.项13的方法，其中所述细胞是癌细胞、肿瘤细胞或已被永生化的细胞。
[0354] 15.项14的方法，其中所述细胞是MDCK、HEK293、Vero、HeLa或PER. C6细胞。
[0355] 16.项13的方法，其中所述细胞是体内或体外的癌细胞。
[0356] 17.项16的方法，其中所述体内癌细胞来自哺乳动物对象。
[0357] 18.项17的方法，其中所述哺乳动物对象是人类对象。
[0358] 19.增加溶瘤病毒在癌细胞中的溶瘤活性的方法，所述方法包括在所述溶瘤述病 毒之前、之后或同时将项8的化合物施用至所述癌细胞，并培养所述溶瘤病毒和癌细胞。 [0359] 20.项19的方法，其中所述癌细胞是体内的或体外的。
[0360] 21.项20的方法，其中所述体内癌细胞来自哺乳动物对象。
[0361 ] 22.项21的方法，其中所述哺乳动物对象是人类对象。
[0362] 23.项1的化合物，其用作病毒敏化剂。
【主权项】
1.2-[二（甲基硫代)亚甲基]丙二腈用于增强细胞培养基中病毒产生的用途，所述培养 基包含病毒以及可被所述病毒感染的细胞。2. 权利要求1的用途，其中所述病毒是流感病毒。3. -种用于增加病毒产生的试剂盒，所述试剂盒包含2-[二（甲基硫代）亚甲基]丙二 腈；以及 所述试剂盒还包含a)病毒;b)-种或更多种癌细胞;c)药学上可接受的载体、稀释剂或 赋形剂;d)非癌细胞;e)细胞培养基;f) 一种或更多种癌治疗剂，g)细胞培养板或多孔皿;h) 向细胞、培养基或对象递送病毒敏化化合物的设备;i)使用所述病毒敏化剂的说明书;j)载 体稀释剂或赋形剂，或a)~j)的任何组合。4. 权利要求3的试剂盒，其中所述病毒是减毒的或遗传修饰的病毒或溶瘤病毒。5. 权利要求3的试剂盒，其中所述病毒是流感病毒。
【文档编号】C12N7/00GK105886476SQ201610169349
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2010年7月7日
【发明人】约翰·贝尔, 让-西蒙·迪亚洛, 法布里斯·勒伯夫
【申请人】渥太华医院研究所