一种从狐狸粪中检测多房棘球绦虫的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测领域，涉及到粪便样品中多房棘球绦虫病原的鉴别。
【背景技术】
[0002] 泡球蝴包虫病（alveolar echinococcosis，AE)是一种由多房棘球绦虫 (Echinococcus multilocularis，Em)引起的致死性人兽共患寄生虫病。由于该病尚无特 效的治疗方法，因此被称为寄生虫病的癌症。AE在我国主要流行于西北部的牧业、半农半牧 地区，其中，青藏高原东部牧区是世界上最严重的疫区。目前，AE已成为我国高原牧区最严 重的公共卫生安全问题之一。
[0003] 藏狐（Vulpes ferrilata)和家犬是藏东牧区Em主要的终末宿主，然而由于家犬 自由活动的范围广泛，并与人类保持密切的联系，现有研究主要集中在家犬传播AE的途径 上。但是，不可否认的是无论家犬还是狐狸都以作为Em中间宿主的野生小型哺乳动物为 食，相关研究发现犬Em的感染率在新疆是17.0% (52/305)，在青海是5.1 % (3/59)，在四 川是 12.0% (45/371) (Chai et al·，2003;王虎等，2000 ;Budke et al·，2005)，而对野生 狐狸Em感染率的调查结果显示在四川省石渠县为59. 1% (13/22)，在青海省称多县和海北 州为33. 3% (4/12)(邱加闽等，1995 ;王虎等，2000)，狐狸的Em感染率均高于家犬。因此， 在我国AE的研究中，非常有必要从野生狐属物种入手，研究AE在野生动物中的流行病学和 生态学特性。这样的研究将为从野生动物疫源疾病的传播源头入手，从生态防治和物种控 制的角度来控制野生动物疫源疾病传播提供重要的研究基础和理论依据，真正实现我国西 部牧区AE的综合有效防治。
[0004] 然而，已有的检测方法如常规的病原学检测法（槟榔碱导泻法和剖检法）、ELISA 检测法、LAMP检测技术等（Dinkel A，et al. Detection of Echinococcus multilocularis in the definitive host ：coprodiagnosis by PCR as an alternative to Necropsy[J]. J Clin Microbiol, 1998, 36(7):1871-1876. ；Eckert J. Predictive values and quality control of techniques for the diagnosis of Echinococcus multilocularis in definitive hosts. Acta Trop,2003, 85 (2):157-163. ；Ni XM.Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)assay for the identification of Echinococcus multilocularis infections in canine definitive hosts. Particle and Fibre Toxicology, 2014, 7 (I) :35-42.)都存在一定的缺点，敏感性和特异性都较低，其中常规检 测法还具有感染人和周围环境的危险。相比于这些技术来鉴别棘球属绦虫虫种，目前广泛 采用的DNA分析方法更为有效和特异（Craig et al.，2007 ;Nakao et al.，2007 ;2010)。粪 便DNA检测技术是一种非损伤性的分子分析方法，适用于通过终末宿主的粪便来诊断是否 感染棘球绦虫（Mathis et al.，1996 ;Dinkel et al.，1998 ;2011 ;Stefanic et al.，2004 ; Trachsel et al. , 2007 ；Hilttner et al. , 2009) 〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供了一种可克服现有技术不足，从狐狸粪便中检测多房棘球绦 虫的方法。
[0006] 本发明提供了一种高效的粪便DNA分析方法来检测藏狐粪便中的多房棘球绦虫 病原，我们首先使用线粒体DNA的细胞色素 b (Cytb)基因片段来区分粪便是否来自藏狐，再 通过巢式PCR扩增粪样中虫卵DNA的特异片段的方法检测和鉴定Em。
[0007] 本发明提供了一种从狐狸粪中检测多房棘球绦虫的方法，该方法包括以下步骤：
[0008] - .藏狐粪便样本，保存在70%乙醇中，置于_80°C冷冻3周以上。
[0009] 二.使用双层灭菌纱布和组织破碎仪富集并振荡破碎步骤一所得粪样中的虫卵， 通过粪便DNA提取试剂盒提取粪样中虫卵DNA。
[0010] 三.巢式PCR扩增步骤二得到的虫卵DNA并鉴定虫卵。巢式PCR扩增时四个特异 引物分别是上游外部引物 ：F1:5'-TTGAATTTGCCACGTTTGAATGC-3'（SEQIDN0.1);下游外 部引物：R1 :5' -GAACCTAACGACATAACATAATGA-3'（SEQ ID NO. 2);上游内部引物：F2 :5' -GT CATAITTGITTMGTATAAGTGG-3'（SEQ ID N0.3);下游内部引物：R2:5'-CACTCTTATTTACACTAG AATTAAG-3'（SEQ ID N0.4)。
[0011] 其中步骤一种藏狐粪便样本为野外收集，具体收集方法为：2010年7月至8月间， 我们在四川省石渠县云波沟通过系统采样布设样线，采用扫荡式采样方法釆集到粪样184 份，所有样品均记录了采样点的GPS位点。根据样本的颜色、形状、水分和气味对其新鲜程 度分了等级，1级为当日的新鲜粪样，即表面有水分和光泽；2级为数日内的较新鲜粪样，表 面颜色较深，外形轮廓明显；3级为1周内粪样，颜色灰白，外形轮廓明显；4级为较老的粪 样，较难辨识。原则上我们只采1级和2级的新鲜类样，但在样线区域内实在找不到新鲜粪 样时，我们也釆集较老的类便。在野外自然环境中保存了一段时间的样品，虽然质量不如新 鲜样品，但也能从中提取出可基本满足研究要求的DNA。我们所采集到的粪样主要分布在草 丛、狐狸洞口、石片上、水源边和土包上。在野外的时候采样时，出于安全考虑，我们用一次 性竹筷夹起样品，保存在50ml装有70 %乙醇的离心管中，回实验室后，-80°C冷冻保存3周 以上。
[0012] 其中步骤一中在野外收集的藏狐粪便样本使用线粒体DNA的细胞色 素 b(Cytb)基因片段来区分粪便是否来自藏狐，具体步骤可参考（Jiang WB，Wang XM, Li M, Wang ZH*(2011)Identification of the Tibetan fox(Vulpes ferrilata) and the red fox (Vulpes vulpes)by copro-DNAdiagnosis, Molecular Ecology Resources, 11(1): 206-210.)
[0013] 其中粪便DNA提取试剂盒为QIAamp DNAStool Mini kit，购自德国Qiagen 公司所述的巢式PCR扩增，为本领域的常规技术，可参考如下文献（Nakao M，Sako Y,Yokoyama N, Fukunaga M, Ito A (2000)Mitochondrial genetic code in cestodes. Mol Biochem Parasitol, 111 :415-424. Nonaka N, Hirokawa H, Inoue T, Nakao R, Ganzorig S,Kobayashi F, Inagaki M, Egoshi K, Kamiya M, Oku Y (2010)The first instance of a cat excreting Echinococcus multilocularis eggs in Japan. Parasitol Int,57:519- 520.)
[0014] 上述多房棘球绦虫具体是指泡球蝴包虫病（alveolar echinococcosis，AE)。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种从狐狸粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒， 其特征在于，该试剂盒包括四个特异引物分别是上游外部引物：Fl :5' -TTGAATTTGCCACGTT TGAATGC-3'（SEQ ID NO. 1);下游外部引物：R1 :5'-GAACCTAACGACATAACATAATGA-3'（SEQ ID N0·2);上游内部引物：F2:5'-GTCATATTTGTTTAAGTATAAGTGG-3'（SEQIDNα3) ;下游内部 引物：R2 :5' -CACTCTTATTTACACTAGAATTAAG-3'（SEQ ID NO. 4)。
[0016] 上述一种从狐狸粪便中检测多房棘球绦虫的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括 粪便DNA提取试剂盒。
[0017] 有益效果
[0018] 本发明在从狐狸粪便中检测多房棘球绦虫病原的过程中采用巢式PCR的特异扩 增，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。
[0019] 粪便中的虫卵数与细菌和病毒相比少得多，而且六钩蝴被胚膜环绕，对许多化学 试剂和酶的裂解具有高度抵抗性。因此，粪便细菌和病毒DNA的提取方法并不适用于虫卵。 所以，为提高粪样中虫卵的检测灵敏度，对虫卵的富集和卵壳的破碎尤为重要。棘球绦虫虫 卵富集的传统方法是利用连续过蹄和氯化碎漂浮结合的方法，而我们采用的反复挤压两层 灭菌纱布包裹的粪渣的方法相对更高效，与前两种方法相比，还降低了交叉污染的可能性。 此外，我们采用组织破碎仪机械振荡破碎虫卵胚膜来释放其中的DNA，虽然存在高速下虫卵 与陶珠碰撞后释放的基因组DNA也有断裂的可能，但与其它诸如超声、液氮反复冻融等卵 壳破碎方法相比，该法节省人力物力，完全密闭的实验状态也保证了样本不受污染。我们在 实验中引入的巢式PCR，进行两轮扩增，相比于传统的单轮PCR，增加了扩增产物量，