提高检 测的灵敏度和特异性。
【附图说明】
[0020] 图1为多房棘球绦虫虫卵被破碎胚膜的显微照片（X400)，其中：(A)机械振荡处 理前带坚厚胚膜的绦虫卵（B)用组织破碎仪以转速5500r/min振荡虫卵15s。（C)用组织 破碎仪以转速5500r/min反复振荡2次，每振荡15s，暂停15s，虫卵胚膜完全破碎。
[0021] 图2为实验样品检测结果的电泳，其中：M为DNA标准分子dLlOOO (Takara) ; 1-12 泳道是藏狐粪便DNA样品，经鉴定，9、10和12道样本存在Em感染，Em+是Em的组织DNA样 本，"一"是阴性对照。
[0022] 图3为巢式PCR引物特异性评价结果的电泳，M为DNA标准分子dLlOOO (Takara); 之后依次是七种寄生虫虫体组织DNA，分别是：Ts为猪带绦虫，Sm为曼氏迭宫绦虫，Dt为阔 节裂头绦虫，Dc为犬复孔绦虫，Eg为细粒棘球绦虫，Es为石渠棘球绦虫，Em为多房棘球绦 虫，"一"是阴性对照。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图对本发明进一步说明。以下实施方式只是较佳的实施方式中的一 种，并非对本发明的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修 饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。未作特殊 说明的实验试剂和方法，均指常规试剂和方法。
[0024] 实施例1
[0025] 1藏狐粪便样本的采集：藏狐粪便样本是从7只无线电追踪的藏狐的家域范围内 收集到的（四川省石渠县俄多马乡云波沟（N 33° 10'，E 97° 39'))，所有样本均保存 在70%乙醇中，出于安全考虑，实验前在一 80°C冷冻保存3周以上。
[0026] 2粪样虫卵富集：取2g粪样置于150ml烧杯中，加入100mL去离子水。80°C水浴 lOmin，剪刀绞碎，混匀。100目滤网对混浊液进行过滤，滤液保存在50ml试管中，将滤液倒 于平铺在平皿内的双层灭菌纱布上，挤压纱布数次，使其中浊液渗出，将其收集在50ml试 管中。3600g离心30min，弃去上清。
[0027] 3虫卵胚膜的破碎：加入600ul ASL，用枪头将其与沉淀混匀，70°C孵育IOmin后一 并吸入到一个放有等量陶珠（直径为 〇· 5mm, Peqlab Biotechnology, Erlangen, Germany) 的组织匀浆管中。匀浆管置于组织破碎仪上，机械振荡破碎虫卵坚厚的胚膜，组织破碎仪参 数设定：转速为5500r/m ;循环数为2次；振荡15s ;暂停15s。结果如图1 (其中：(A)机械 振荡处理前带坚厚胚膜的绦虫卵（B)用组织破碎仪以转速5500r/min振荡虫卵15s。（C)用 组织破碎仪以转速5500r/min反复振荡2次，每振荡15s，暂停15s，虫卵胚膜完全破碎）。
[0028] 4奠样DNA提取：根据奠便DNA提取试剂盒（Qiagen，QIAamp DNA Stool Mini kit) 说明书提取粪样中宿主DNA和虫卵DNA。
[0029] 5巢式PCR扩增鉴定虫卵：四个特异引物分别是上游外部引物： Fl :5' -TTGAATTTGCCACGTTTGAATGC-3' ；下游外部引物：R1 :5' -GAACCTA AC GACATAACATAATGA-3' ；上游内部引物：F2 :5' -GTCATATTTGTTTAAGTATAAGTGG-3' ；下游内部 引物：R2 :5 ' -CACTCTTATTTACACTAGAATTAAG-3 '。巢式PCR内、外侧引物对扩增体系均为 20 μ L，包含50-100ng模板DNA (第二轮PCR扩增模板为2 μ 1)，5'端引物和3'端引物各 0· 2 μ M，dNTP 各 200 μ Μ，10 X buffer (含 15mmol/L MgCl2) 2 μ I，IU Taq 酶和 2 % BSA0. 5 μ 1。； 同时设阳性（多房棘球绦虫成虫DNA)和阴性对照。两轮PCR扩增条件均为95°C 5min， 94°C 30s，52°C 45s，72°C 90s，共35循环，72°C 10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，根据 结果判断粪样中是否存在多房棘球绦虫的遗传物质，结果如图2 (其中：M为DNA标准分子 dL1000 (Takara) ; 1-12泳道是藏狐粪便DNA样品，经鉴定，9、10和12道样本存在Em感染， Em+是Em的组织DNA样本，"一"是阴性对照）。我们提取了猪带绦虫（Taenia solium)、曼 氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni)、阔节裂头绦虫（Diphyllobothrium latum)、犬复孔绦 虫（Dipylidium caninum)、细粒棘球绦虫（E. granulosus)和石渠棘球绦虫（E. shiquicus) 七种不同的寄生虫DNA，采用相同的巢式PCR检测方法，通过对实验结果的分析，探讨该方 法的特异性，结果如图3。
[0030] 本发明在从狐狸粪便中检测多房棘球绦虫病原的过程中采用巢式PCR的特异扩 增，具有简便、快捷、廉价和准确性高的特点。
[0031] 实施例2
[0032] 我们设计了巢式PCR法来筛查狐粪中存在的多房棘球绦虫遗传物质。外侧引物选 用带科通用引物（Fl，Rl)扩增线粒DNA细胞色素氧化酶I亚基基因（COI)部分序列，长度 为874bp。内侧引物用Primer Premier 5. 0软件进行设计，产物长度为243bp。
[0033] 实施例3巢式PCR的效果评价
[0034] 我们从2010年总共收集的184份粪样中随机选取72份样品来评价所建立的粪便 DNA巢式PCR诊断方法。其中成功提取到48份样本DNA，经物种鉴定，全部来自藏狐。在对 粪样中绦虫虫卵进行富集和破碎的处理后（图1)，我们用巢式PCR和Xia 〇(Xia〇 N，Nakao M, Qiu JM1Budke CM1Giraudoux P1Craig PS1Ito A(2006a) Short Report:Dual infection of animal hosts with different species of Echinococcus in the eastern Qinghai - Tibetan Plateau region of China. Am J Trop Med Hyg, 75:292 - 294.)建立的PCR-RFLP 两种方法分别筛查狐粪中存在的Em遗传物质，发现两种方法的检测结果存在显著差异 〈0.001，配对样本的Wilcoxon符号检验）。48个粪样中，巢式PCR检测9(19% )个样品感 染Em，而PCR-RFLP只检测到3 (6% )个样品感染感Em。此外，所有在PCR-RFLP方法中检测 到呈阳性的样本均在巢式PCR中得到确认（表1)。
[0035] 表1两种方法对藏狐粪便中棘球绦虫虫卵检测结果比较
【主权项】
1. 一种从狐狸粪中检测多房棘球绦虫的方法，该方法包括以下步骤： A. 藏狐粪便样本，保存在70%乙醇中，置于-80°C冷冻3周以上； B. 使用双层灭菌纱布进行粪样虫卵富集并利用组织破碎仪进行虫卵胚膜的破碎，通过 粪便DNA提取试剂盒提取粪样中虫卵DNA ; C. 巢式PCR扩增步骤B得到的虫卵DNA并鉴定虫卵，巢式PCR扩增时四个特异引物分 别是上游外部引物：Fl如SEQ ID NO. 1所示；下游外部引物：R1如SEQ ID NO. 2所示；上游 内部引物：F2如SEQ ID NO. 3所示；下游内部引物：R2如SEQ ID NO. 4所示。2. 很据权利要求1所述的一种从狐狸粪中检测多房棘球绦虫的方法，其特征在于，所 述多房棘球绦虫具体是指泡球蝴包虫病。3. 很据权利要求1所述的一种从狐狸粪中检测多房棘球绦虫的方法，其特征在于，步 骤A中藏狐粪便样本的采集方法为：野外收集藏狐粪便样本，通过系统采样布设样线，采用 扫荡式采样方法釆集到粪样，所有样品均记录采样点的GPS位点；根据样本的颜色、形状、 水分和气味对其新鲜程度分等级级为当日的新鲜粪样，即表面有水分和光泽；2级为数 日内的较新鲜粪样，表面颜色较深，外形轮廓明显；3级为1周内粪样，颜色灰白，外形轮廓 明显；4级为较老的粪样，较难辨识；原则上只采1级和2级的新鲜类样，但在样线区域内实 在找不到新鲜粪样时，也可釆集较老的类便；所采集到的粪样主要分布在草丛、狐狸洞口、 石片上、水源边和土包上；在野外的时候采样时，用一次性竹筷夹起样品。4. 很据权利要求3所述的一种从狐狸粪中检测多房棘球绦虫的方法，其特征在于，野 外收集的藏狐粪便样本使用线粒体DNA的细胞色素b基因片段来区分粪便是否来自藏狐。5. -种从狐狸粪便中检测多房棘球绦虫病原的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括四 个特异引物，分别是上游外部引物：Fl如SEQ ID NO. 1所示；下游外部引物：R1如SEQ ID NO. 2所示；上游内部引物：F2如SEQ ID NO. 3所示；下游内部引物：R2如SEQ ID NO. 4所 不。6. 根据权利要求5所述的一种从狐狸粪便中检测多房棘球绦虫的试剂盒，其特征在 于，该试剂盒包括粪便DNA提取试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种从狐粪中检测多房棘球绦虫(Echinococcus？multilocularis)病原的方法。本发明所提供的方法包括以下步骤：将收集的藏狐粪便样本置于70％乙醇中，-80℃冷冻保存3周以上。通过双层灭菌纱布富集粪样虫卵，利用组织破碎仪机械振荡破碎虫卵胚膜，使用粪便DNA提取试剂盒提取粪样中虫卵DNA，巢式PCR扩增鉴定虫卵。此方法操作简单，能快速检测狐粪中是否存在多房棘球绦虫的感染，敏感性高，特异性强。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105018613
【申请号】CN201510422480
【发明人】蒋韦斌, 王正寰, 王小明
【申请人】上海师范大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月17日