基因elovl6检测猪脂肪沉积的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于猪脂肪沉积检测领域，尤其是涉及一种基因 EL0VL6检测猪脂肪沉积 的方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪组织最重要和最被广泛了解的功能就是在能量过剩时以甘油三脂的形式储 存能量而在饥饿状态下利用这些能量。脂肪组织曾经一直被认为是一个无活性的被动组 织。但是，近三十多年的研究证实，脂肪组织不仅仅是一个能量储存器官，更是一个重要的 内分泌器官，它能分泌许多因子，包括瘦素（1印tin)，肿瘤坏死因子alpha (TNFa)，诱导细 胞死亡的DFF45样效应因子（CIDEC)和脂肪酸延长因子6 (EL0VL6)等，这些因子统称脂肪 细胞因子，它们在脂代谢和能量平衡中起着重要的作用。
[0003] ELOVL家族共7个成员，分别命名为ELOVLl~7。EL0VL6是ELOVL家族中的第6个 成员，主要表达于肾上腺，肝、脑、脂肪组织、睾丸、皮肤等合成和储存脂肪的组织细胞结构， 除在睾丸中的转录物为2. 5kb外，在其余组织中的转录物均为6kb。EL0VL6主要促成12C~ 16C饱和与不饱和脂肪酸延伸为18C脂肪酸，EL0VL6是长链脂肪酸合成和延伸的限速酶，有 研究表明，EL0VL6作为一种重要的代谢调控因子，在脂质异常代谢，胰岛素抵抗中发挥重要 作用。
[0004] 脂肪对于维持畜禽生命、生长和生产有着不可取代的重要作用。但是，由于近几十 年来过于注重体重的增长，导致畜禽生产周期日益缩短，而脂肪沉积却日趋增多。过多的脂 肪沉积不仅会诱发畜禽疾病，还会降低畜产品的价值。猪是人们重要的肉类来源之一，在生 长过程中及时、动态的监测其机体脂肪的沉积状况，从而防止脂肪的过度沉积，对于猪的养 殖和生产具有很重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种快速准确、操作方便且不影响猪正常生长的 基因 EL0VL6检测猪脂肪沉积的方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：基因 EL0VL6检测猪脂肪沉积的 方法，利用基因 EL0VL6在脂肪组织中的表达水平来检测猪脂肪沉积。
[0007] 上述基因 EL0VL6检测猪脂肪沉积的方法，通过定量PCR来检测基因 EL0VL6在脂 肪组织里mRM的表达量，用于定量PCR基因 EL0VL6特异片段的引物对分别具有以下碱基 序列：
[0008] Forward primer (Pl) ：AGAACACGTAGCGACTCCGAAGAT ；
[0009] Reverse primer(P2) :GACATGCCGACCGCCAAAGATAA〇
[0010] 上述基因 EL0VL6检测猪脂肪沉积的方法，包括以下步骤：
[0011] ⑴从被检测的猪组织中抽提总RNA，反转录得到相应的cDNA样品；
[0012] (2)用引物对Forward primer和Reverse primer对步骤（1)中的cDNA样品进行 定量PCR。
[0013] 步骤（1)中的反转录反应体系和条件为：在20 μ 1反转录体系中，4 μ I RNA， 2μ1 01ig(dT)，4yl DEPC 水，70°C10min，冰急冷 2min;然后加入：4μ1 Buffer(TaKaRa 5 X Reverse Transcriptase M-MLV Buffer) , I μ I dNTP (Solarbio dNTP Mix),0. 5μ1 RRI(TaKaRa)，0·5μ I M-MLV (TaKaRa Reverse Transcriptase M_MLV)，4 μ I DEPC 水， 42°C lh，9(TC 10min，2(TC 2min ;-2(TC保存。
[0014] 步骤（2)中定量PCR扩增步骤的反应体系和反应条件为：
[0015] 反应体系：在20 μ 1定量PCR反应体系中，含有1 μ I cDNA模板，10 μ SYBR Premix Ex Ta 定量 ΙΙ2Χ (TaKaRa SYBR'f, Premix Ex Ta 定量 ? II (Tli RNaseH Plus)试剂盒）， 0·4μ1 ROX Reference DyeII50X (TaKaRa SYBR，： Premix Ex Ta 定量 ? II(Tli RNaseH Plus)试剂盒），1μΜ的ΙμL引物Ρ1，1μΜ的ΙμL引物P2,6. 6μ1无菌去离子水；
[0016] 反应条件：951€308;951€58,60 1€308,40个循环；95°(：158,60°(：1111丨11，951€308， 60°C 15s〇
[0017] 针对目前猪的养殖和生产中缺乏有效监测其机体脂肪沉积状况的措施，发明人研 究发现，在动物体正常生长阶段，EL0VL6促进12C~16C饱和与不饱和脂肪酸延伸为18C脂 肪酸，同时，EL0VL6的表达量上升，以促进动物体的脂肪沉积。EL0VL6的表达水平与体重指 数和内脏脂肪含量正相关，实验证明，EL0VL6与脂肪沉积正相关。据此，发明人建立了一种 基因 EL0VL6检测猪脂肪沉积的方法，利用基因 EL0VL6在脂肪组织中的表达水平来检测猪 脂肪沉积。该法具有快速准确、操作方便且不影响猪正常生长的特点，适用于在养殖过程中 动态监控猪脂肪沉积情况以便于随时掌握猪生长状况。
【附图说明】
[0018] 图1是基因 EL0VL6在3月龄、5月龄、8月龄猪脂肪组织中的相对表达量条形图。
[0019] 图2是基因 EL0VL6在猪脂肪组织中的相对表达量与猪背膘厚度的相关性曲线图。
【具体实施方式】
[0020] 一、研究设计
[0021] 对巴马香猪进行正常喂食处理，采集3月龄、5月龄、8月龄检测脂肪酸延长因子 EL0VL6的表达水平，考察EL0VL6的表达量与脂肪沉积率的关系。
[0022] 利用NCBI数据库中公开发表的猪（sus scrofa)的EL0VL6序列（序列登录号：GI : 545846426 ;参见网址：NCBI 数据 http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/)，成功设ir| 对特异性 定量引物，可检测猪的基因组中其相对表达量。猪（sus scrofa)的EL0VL6特异片段，序列 全长为383bp。猪的看家基因甘油醛-3-脱氢酶基因 GAPDH特异片段，序列全长为1341bp。
[0023] 用于定量PCR上述EL0VL6特异片段的引物对，其碱基序列为：
[0024] Forward primer (Pl) ：AGAACACGTAGCGACTCCGAAGAT ；
[0025] Reverse primer(P2) :GACATGCCGACCGCCAAAGATAA〇
[0026] 用于定量PCR猪的看家基因甘油醛-3-脱氢酶GAPDH特异片段的引物，其碱基序 列为：
[0027] Forward primer ：CGTGTCGGTTGTGGATCTGA ；
[0028] Reverse primer :TGACGAAGTGGTCGTTGAGG〇
[0029] 二、研究方法
[0030] I、样品的制备和处理