br>[0037]其中，所述300 μ L的消化液由255 μ L TNE缓冲液、15 μ L 10 % SDS聚丙烯酰胺和30yL 2 mg/ mL蛋白酶K组成的混合溶液；所述酚仿为苯酚:氯仿:异戊醇按照质量比为25: 24: I混合的溶液。
[0038]步骤三，采用PCR技术检测DNA中的0RF2基因片段。
[0039](I)以步骤二提取的DNA为模板，采用20 μ L的缓冲液TE溶解DNA模板配制成浓度为10ng/ μ L的样品DNA，与浓度为10umol/L的PCR引物配成如下反应体系:
10XPCR 缓冲液:2.5yL dNTP:2 yL 上游引物:1 yL 下游引物:iyL 样品 DNA: 4 μ L Taq 酉每:0.5 μ L
其中，上游引物为:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT，下游引物为:CGC ACC TTC GGA TATACT GTCo
[0040](3)按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下:
1.预变性95°C5分钟
2.变性94°C I分钟
3.退火57 °C I分钟
4.延伸72 °C I分钟 2至4循环30次
5.延伸72°C 10分钟最后4°C保护
步骤四，琼脂糖电泳检测。取出PCR终产物10 μ L，0.8%琼脂糖电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图3所示，其中，泳道M为marker，泳道+为阳性对照，泳道-为阳性对照，泳道1-10为B厂家样品DNA，可见1-10均未有目标条带出现。
[0041]评价圆环疫苗的免疫效果。检测结果表明:B厂家选取的接种圆环疫苗的十头母猪中，均呈现阴性。B厂家给母猪接种的圆环疫苗能有效的阻断圆环疫苗病毒的感染，免疫效果好。
[0042]实施例3
选取C厂家十头母猪在产前28天接种圆环疫苗，并对母猪进行圆环疫苗免疫效果评价，参照图1所示，其为本发明实施例圆环疫苗免疫效果评估方法流程图，包括以下步骤:预处理步骤:取干净的青霉素瓶和瓶塞清洗干净，煮沸灭菌30分钟，烘干后收集备用。
[0043]步骤一，选取经圆环疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血作为样品，将所述样品收集在同一个灭菌的青霉素瓶内并盖上瓶塞密封，共收集10组样品。用标签纸或者医用白胶带在青霉素瓶做标记，注明采集时间，母猪耳号，胎次信息。需要说明的时，当仔猪非连续产出时，需要将已采集的仔猪的脐带血在-30°C冰箱内保存，在该温度条件下能够维持病毒稳定存活，减少实验误差。
[0044]步骤二:提取样品中的DNA。
[0045]①取样品900 μ L，向样品中加入300 μ L的消化液在47 °(:水浴消化3小时，接着加入等体积的酚仿混匀后在12000r/分钟条件下离心13分钟，取上清液，反复抽提3次。
[0046]②向上清液中加入体积为上清液2倍的无水乙醇，室温放置12分钟沉淀DNA，接着在12 000 r/分钟条件下离心10分钟，沉淀用70 %乙醇清洗I次，接着在12000 r/分钟条件下离心15分钟，沉淀自然干燥13分钟。
[0047]其中，所述300 μ L的消化液由255 μ L TNE缓冲液、15 μ L 10 % SDS聚丙烯酰胺和30 μ L 2 mg/ mL蛋白酶K组成的混合溶液；所述酚仿为苯酚:氯仿:异戊醇按照质量比为25: 24: I混合的溶液。
[0048]步骤三，采用PCR技术检测DNA中的0RF2基因片段。
[0049](I)以步骤3提取的DNA为模板，采用20 μ L的缓冲液TE溶解DNA模板配制成浓度为150ng/ μ L的样品DNA，与浓度为15umol/L的PCR引物配成如下反应体系:
10XPCR 缓冲液:2.5yL dNTP:2 yL 上游引物:1 yL 下游引物:iyL 样品 DNA: 4 μ L Taq 酉每:0.5 μ L
其中，上游引物为:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT，下游引物为:CGC ACC TTC GGA TATACT GTCo
[0050](4)按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下:
1.预变性95°C5分钟
2.变性94°C I分钟
3.退火57 °C I分钟
4.延伸72 °C I分钟 2至4循环30次
5.延伸72°C 10分钟最后4°C保护
步骤四，琼脂糖电泳检测。取出PCR终产物10 μ L，0.8%琼脂糖电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图4所示，其中，泳道M为marker，泳道+为阳性对照，泳道-为阳性对照，泳道1-10为C厂家样品DNA，可见泳道4和8特异性扩增出493bp的条带，泳道1、2、3、5、6、7、9和10未有目标条带出现。
[0051]评价圆环疫苗免疫效果，检测结果表明:C厂家选取的接种圆环疫苗的十头母猪中，有两头母猪呈现阳性，其余呈阴性。呈阳性的两头母猪接种的圆环疫苗没有阻断圆环病毒通过血胎屏障侵袭胎儿。C厂家给母猪接种的圆环疫苗不能有效的阻断圆环疫苗病毒的感染，部分母猪仍能通过脐带血传播进而影响胎儿。
[0052]由上述描述可以看出，本发明实施例选取的样品为脐带血，采用PCR技术检测脐带血中的0RF2基因片段来评价圆环疫苗的免疫效果。脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，脐带是连接母体和胎儿的器官，正常的脐带血是不含病原体和抗体物质，通过选取脐带血作为样品研究圆环病毒的垂直传播来评价圆环疫苗的免疫效果更加直接有效。其次，当猪群处于亚健康状态时，免疫系统抑制现象严重，采用血清学检测技术不能直接有效评价免疫效果。本发明实施例通过PCR技术检测脐带血中0RF2基因片段来评价圆环疫苗是否有效阻断圆环病毒通过母猪传染给仔猪，灵敏度更高。
[0053]所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，选取圆环疫苗免疫后的母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血混合作为样品，利用PCR技术扩增样品中目标基因片段，采用琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。2.根据权利要求1所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，具体包括以下步骤: 步骤一:采集经圆环疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血，所述所有同窝仔猪的脐带血混合后作为样品，将所述样品密封保存； 步骤二:提取所述样品中的DNA ; 步骤三:利用PCR技术扩增DNA中的0RF2基因片段； 步骤四:采用琼脂糖凝胶电泳检测是否存在扩增产物评价圆环疫苗的免疫效果。3.根据权利要求1或2所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述母猪在产前21~28天接种圆环疫苗。4.根据权利要求2所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述步骤一中，每头仔猪采集3~5滴脐带血。5.根据权利要求2所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述步骤一中，当仔猪非连续产出时，需要将已采集的仔猪的脐带血在-20~-30°C冰箱内保存。6.根据权利要求2所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述步骤三中，PCR扩增引物为: 上游引物:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT 下游引物:CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC。7.根据权利要求6所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述步骤四的检测为检测是否出现493bp的条带。8.根据权利要求2所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述步骤二提取样品中的DNA步骤包括: ①取样品900μ L，向样品中加入300 μ L的消化液在45~50 °(:水浴消化3~4小时，接着加入等体积的酚仿混匀后在12000r/分钟条件下离心10~15分钟，取上清液，反复抽提3~4次； ②向上清液中加入体积为上清液2倍的无水乙醇，室温放置10~15分钟沉淀DNA，接着在12000 r/分钟条件下离心10~15分钟，沉淀用70 %乙醇清洗I次，继续在12000 r/分钟条件下离心10~15分钟，沉淀自然干燥10~15分钟；提取的DNA采用20 μ L的缓冲液TE溶解备用； 其中，所述300 μ L的消化液由255 μ L TNE缓冲液、15 μ L 10 % SDS聚丙烯酰胺和30yL 2 mg/ mL蛋白酶K组成的混合溶液；所述酚仿为苯酚:氯仿:异戊醇按照质量比为25: 24: I混合的溶液。9.根据权利要求1所述的圆环疫苗免疫效果评估方法，其特征在于，所述步骤三中的PCR技术检测方法包括以下步骤: Cl)按如下比例配制PCR反应体系: PCR缓冲液:2.5 μ L dNTP:2 yL 上游引物:1 yL 下游引物:iyL 样品 DNA: 4 μ L Taq 酉每:0.5 μ L 其中，样品DNA浓度为100-200ng/ μ L，上游引物及下游引物浓度为10~20umol/L ;所述上游引物为:CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT，所述下游引物为:CGC ACC TTC GGA TAT ACTGTC ； (2)95°C预变性5分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72°C延伸10分钟，最后4°C保护； 所述PCR循环参数为:94°C变性I分钟，57°C退火I分钟，72°C延伸I分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种圆环疫苗免疫效果评估方法，包括以下步骤：（1）采集经圆环疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血，所述所有同窝仔猪的脐带血混合后作为样品，将所述样品密封保存；（2）提取所述样品中的DNA；（3）利用PCR技术扩增DNA中的ORF2基因片段；（4）采用琼脂糖凝胶电泳检测是否存在扩增产物评价圆环疫苗的免疫效果。本发明通过PCR技术检测脐带血样品中目标基因片段，能直接有效判断圆环疫苗是否有效阻断圆环病毒通过母猪传染给仔猪，更加准确地评估圆环疫苗的免疫效果，灵敏度高。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105018615
【申请号】CN201510425018
【发明人】喻正军, 李增强, 王贵平, 黄岚芬, 李伦勇, 刘清钢
【申请人】湖南新南方养殖服务有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月20日