白芍品种检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物品种鉴别方法，特别是涉及一种白芍品种检测方法。
【背景技术】
[0002] ISSR (inter-simple sequence repeat)是 Zietkeiwitcz 等于 1994 年发展起来的 一种微卫星基础上的分子标记技术。其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序 列的3'端或5'端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火， 导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，而扩增谱带多为显性表现。
[0003] 根据现代分子生物学研究表明，中药材（不含矿物药）的生物种质资源多样性是 由于其基因多态性导致的结果，而基因多态性可在DNA分子标记技术水平进行检测，这是 比在形态、组织和细胞水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。ISSR揭示的多态性较 高，可获得几倍于RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)的 信息量，精确度几乎可与RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段 长度多态性）相媲美。
[0004] 白苟（Radix Paeoniae)，别名苟药，多年生草本，为毛茛科（Ranunculaceae)植物 芍药（Paeonia IactifloraPall)的去皮干燥根，性微苦，味苦酸。其主要成分为芍药苷、芍 药内酯苷、氧芍药苷、苯甲酰芍药苷，通称芍药总苷。具有抗炎、抗病毒、解痉镇痛、护肝等多 种药理活性。白芍在我国栽培已有3900多年的历史，由于其药理活性强，临床应用广泛，白 芍长期以来就被作为多种中药和新药的主要原料。由于大部分栽培白芍药材仅经过短期引 种和驯化，在传统的白芍道地药材中可能存在着一些经过多年选择但未完全纯化的地方优 良品种。我国的白芍历来有三大传统品种，即产区为安徽亳州的亳白芍、浙江东阳等地的杭 白芍以及四川中江等地的川白芍。另外在山东、陕西和江苏等地也有白芍产出。道地白芍 疗效好，品质佳，成为商品白芍的最佳选择。
[0005] 近年来随着中药市场的快速发展，新的白芍种植基地不断出现。白芍历来以亳、 杭、川为道地，据胡世林等的研究报道，单以芍药苷含量而论，亳芍、川芍要优于杭芍，同时 他发现山东曹县产的白芍尽管没有名气，但其外观与以上道地产品类似，芍药苷含量高达 1.95%，提示该处可能成为新兴的道地产区。白芍药材来源除了部分来自种植基地外，大量 原药材仍来自散户的收购。因此，生产条件的不规范导致白芍药材质量参差不齐；同时由于 长期的分散种植，目前白芍种质遗传结构、来源不是很清楚，有的来自原产地，有的来自不 同时期的引种品，有的是同地不同种，因此原植物遗传结构有较大程度的变异，品种间可能 存在相当的混杂度。有必要从源头及白芍种质资源、种植规范方面严格要求，搞清白芍药材 的道地性，建立品种质量标准，指导GAP (Good Agriculturing Practice，中药材生产质量 管理规范）标准化生产。
[0006] 而对道地药材种源的遗传分析、品种科学鉴定和标记是解决白芍种植的品种混乱 问题和检验原材料市场上存在的品质优劣的基础，是保证道地白芍药材道地性的关键。道 地性白芍和非道地性白芍外观形态、质地纹理都非常相似，运用传统方法很难准确区分道 地性白芍和非道地性白芍。
【发明内容】
[0007] 基于此，有必要针对上述问题，提供一种白芍品种检测方法，该方法以白芍基因的 多态性为基础，在DNA分子标记技术水平进行检测，对白芍的品种进行鉴别，从基因水平区 分道地性白芍和非道地性白芍。
[0008] 一种白芍品种检测方法，包括以下步骤：
[0009] 建立鉴别模型：取不同品种的白芍，分别提取其DNA，然后将所提取到的DNA用引 物进行聚合酶链式反应扩增，得到扩增产物，并对该扩增产物进行电泳分离，得到不同品种 白芍的DNA电泳图，以该电泳图的谱图信息建立白芍品种鉴别模型；
[0010] 品种鉴别：取待测白芍，按照上述方法得到其DNA电泳图，将该待测白芍电泳图的 谱图信息代入上述鉴别模型中进行分析，判定得到该白芍的品种；
[0011] 所述引物包括以下引物中的至少一种：
[0026] 本发明以DNA水平的分子标记为基础，建立了上述白芍品种检测方法，相对于传 统形态鉴定具有巨大优势，在白芍药材的研究和应用中，为解决品种混乱和品种优劣问题 提供了一种新的手段，也为白芍的引种和培育工作提供了技术支持。且该方法具有快速简 便，只需要少量样本即可实现的特点，可以鉴别白芍种苗的品种，从而可从基因水平选择种 植品种，从源头上保证药材的质量。
[0027] 并且，本发明通过筛选，得到上述ISSR引物，以该引物进行PCR扩增，得到的产物 能反映白芍品种的差异和类别，以该方法对白芍品种进行检测，具有分类准确，方法稳定且 重复性好的优点。
[0028] 在其中一个实施例中，所述引物由引物1-引物13组成。选用上述所有引物作为 一个组合整体，所得到的PCR扩增产物具有电泳谱图信息丰富多样且稳定的特点，最能体 现白芍品种的差异和类别。
[0029] 在其中一个实施例中，所述聚合酶链式反应扩增的反应体系为：DNA模板的浓度 为30~80ng/25 μ L，DNA聚合酶的浓度为I. 0~2. 0U/25 μ L，镁离子的浓度为1. 5~2. 5m mol/L，dNTPs的浓度为180~270 μ mol/L，每种引物的浓度均为0. 2~0. 5 μ mol/L。上述 反应体系具有较好的扩增效果，能够得到稳定且高质高量的扩增产物，利于后续的分离及 鉴别。
[0030] 在其中一个实施例中，所述聚合酶链式反应扩增的反应程序为：首先93~98°C变 性3-5分钟，93~98°C变性40-50秒，51~58°C退火40-50秒，然后70~75°C延伸80-100 秒，30-40个循环；最后70~75°C延伸8-12分钟。上述反应程序具有较好的扩增效果，能 够得到稳定且高质高量的扩增产物，利于后续的分离及鉴别。
[0031] 在其中一个实施例中，所述谱图信息通过以下方法得到：对电泳图上重复性好且 条带清晰的电泳条带计数，有条带记为1，无条带记为〇,得到〇、1矩阵数据，该矩阵数据即 为谱图信息。
[0032] 在其中一个实施例中，根据所述谱图信息，算出各品种的白芍之间的相似系数，并 进行聚类分析，得到不同品种白芍的鉴别模型。
[0033] 在其中一个实施例中，提取白芍DNA的方法如下：将白芍置于预冷的研钵中，加 入液氮研磨成细粉，迅速转移至离心管中；加入60-70°C预热的十六烷基三甲基溴化铵 缓冲液，60-70°C水浴20-60分钟；冷却至室温，加入体积比为20-28:1的氯仿：异戊醇混 合溶液混匀，10000-14000rpm离心10-20分钟，取上清液，加入NaAc和无水乙醇，混匀后 10000_14000rpm离心3_7min，弃上清，得到DNA沉淀；再加入60-80%的乙醇溶液洗涤DNA 沉淀，并将该DNA沉淀于室温晾干，即得。
[0034] 在其中一个实施例中，所述电泳分离的条件为：用琼脂糖凝胶电泳法进行电泳，电 泳电压为120~180V，电泳时间为0. 5h~lh。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0036] 本发明的白芍品种检测方法，首先根据已知品种的白芍DNA建立品种鉴别模型， 再将待测白芍的DNA信息带入该鉴别模型中，以DNA水平的分子标记为基础进行白芍品种 的检测，为道地性白芍和非道地性白芍的区分提供了有效可靠的鉴定手段。相对于传统形 态鉴定具有巨大优势，在白芍药材的研究和应用中，为解决品种混乱和品种优劣问题提供 了一种新的手段，也为