分为：2. 5 μ L 10 X buffer缓冲液（即 DNA凝胶加样缓冲液），2. 5 μ L浓度为25mmol/L的MgCl2,0. 5 μ L浓度为lOmmol/L的dNTPs， 1. 25 μ L浓度为10 μ mol/L的弓丨物，上述得至Ij的DNA模板50ng，0· 1 μ L浓度为5U/ μ L的DNA 聚合酶，剩余体积用超纯水补足。
[0097] 将上述得到的扩增产物用用琼脂糖凝胶电泳进行电泳分离，与实施例1相比，电 泳条带模糊，较难进行后续的聚类分析和相似系数的计算。
[0098] 实施例4
[0099] -种白芍品种检测方法，与实施例1的方法基本相似，不同之处在于：
[0100] 为了得到扩增产物，所采用的聚合酶链式反应体系成分为：
[0101] 聚合酶链式反应体积为25 μ L。反应体系成分为：2. 5 μ LlOXbuffer缓冲液（即 DNA凝胶加样缓冲液），2. 5 μ L浓度为25mmol/L的MgCl2,0. 75 μ L浓度为lOmmol/L的 dNTPs，0. 75 μ L浓度为10 μ mol/L的引物，上述得到的DNA模板20ng，0. 3 μ L浓度为5U/ μ L 的DNA聚合酶，剩余体积用超纯水补足。
[0102] 将上述得到的扩增产物用用琼脂糖凝胶电泳进行电泳分离，与实施例1相比，电 泳条带模糊，较难进行后续的聚类分析和相似系数的计算。
[0103] 对比例1
[0104] 一种白芍品种检测方法，与实施例1的方法基本相似，不同之处在于：
[0105] 采用的引物为：
[0106] PRl：TATATATATATATATAC
[0107] PR2 ：CTCTCTCTCTCTCTCTG
[0108] PR5 ：GTGTGTGTGTGTGTGTC
[0109] 采用以上引物进行聚合酶链式反应之后，用琼脂糖凝胶电泳分别对聚合酶链式反 应产物进行电泳分离，结果是无电泳条带，无法进行后续的聚类分析和相似系数的计算。
[0110] 对比例2
[0111] 一种白芍品种检测方法，与实施例1的方法基本相似，不同之处在于：
[0112] 采用的引物为：
[0113] PR3 ：ACACACACACACACACT
[0114] PR4:TGTGTGTGTGTGTGTGG
[0115] 采用以上引物进行聚合酶链式反应之后，用琼脂糖凝胶电泳分别对聚合酶链式反 应产物进行电泳分离，结果是条带无多态性，即所有样品的电泳条带无区别，无法进行后续 的聚类分析和相似系数的计算。
[0116] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0117] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种白芍品种检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 建立鉴别模型：取不同品种的白芍，分别提取其DNA，然后将所提取到的DNA用引物进 行聚合酶链式反应扩增，得到扩增产物，并对该扩增产物进行电泳分离，得到不同品种白芍 的DNA电泳图，以该电泳图的谱图信息建立白芍品种鉴别模型； 品种鉴别：取待测白芍，按照上述方法得到其DNA电泳图，将该待测白芍电泳图的谱图 信息代入上述鉴别模型中进行分析，判定得到该白芍的品种； 所述引物包括以下引物中的至少一种： 引物 I :AGAGAGAGAGAGAGAGT ; 引物 2 :AGAGAGAGAGAGAGAGC ; 引物 3 :AGAGAGAGAGAGAGAGG ; 引物 4 :GAGAGAGAGAGAGAGAC ; 引物 5 :CACACACACACACACAA ; 引物 6 :CACACACACACACACAG ; 引物 7 :ACACACACACACACACT ; 引物 8 :ACACACACACACACACC ; 引物 9 :AGAGAGAGAGAGAGAGYT ; 引物 10 :AGAGAGAGAGAGAGAGYA ; 引物 11 :GAGAGAGAGAGAGAGAYT ; 引物 12 :GAGAGAGAGAGAGAGAYG ; 引物 13 :CACACACACACACACARC ; 其中：R为A或T，Y为C或G。2. 根据权利要求1所述的白芍品种检测方法，其特征在于，所述引物由引物1-引物13 组成。3. 根据权利要求1所述的白芍品种检测方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应 扩增的反应体系为：DNA模板的浓度为30~80ng/25 yL，DNA聚合酶的浓度为I. 0~ 2. OU/25 y L，镁离子的浓度为L 5~2. 5mmol/L，dNTPs的浓度为180~270 y mol/L，每种 引物的浓度均为〇? 2~0? 5 ymol/L〇4. 根据权利要求3所述的白芍品种检测方法，其特征在于，所述聚合酶链式反应扩增 的反应程序为：首先93~98 °C变性3-5分钟，93~98 °C变性40-50秒，51~58 °C退火40-50 秒，然后70~75°C延伸80-100秒，30-40个循环；最后70~75°C延伸8-12分钟。5. 根据权利要求1-4任一项所述的白芍品种检测方法，其特征在于，所述谱图信息通 过以下方法得到：对电泳图上重复性好且条带清晰的电泳条带计数，有条带记为1，无条带 记为0,得到〇、1矩阵数据，该矩阵数据即为谱图信息。6. 根据权利要求5所述的白芍品种检测方法，其特征在于，根据所述谱图信息，算出各 品种的白芍之间的相似系数，并进行聚类分析，得到不同品种白芍的鉴别模型。7. 根据权利要求1所述的白芍品种检测方法，其特征在于，提取白芍DNA的方法如 下：将白芍置于预冷的研钵中，加入液氮研磨成细粉，迅速转移至离心管中；加入60-70°C 预热的十六烷基三甲基溴化铵缓冲液，60-70°C水浴20-60分钟；冷却至室温，加入体积比 为20-28:1的氯仿：异戊醇混合溶液混匀，10000-14000rpm离心10-20分钟，取上清液，加 入NaAc和无水乙醇，混勾后10000-14000rpm离心3-7min，弃上清，得到DNA沉淀；再加入 60-80%的乙醇溶液洗涤DNA沉淀，并将该DNA沉淀于室温晾干，即得。8.根据权利要求1所述的白芍品种检测方法，其特征在于，所述电泳分离的条件为：用 琼脂糖凝胶电泳法进行电泳，电泳电压为120~180V，电泳时间为0. 5h~lh。
【专利摘要】本发明涉及一种白芍品种检测方法，属于植物品种鉴别技术领域。该方法包括以下步骤：建立鉴别模型：取不同品种的白芍，分别提取其DNA，然后将所提取到的DNA用引物进行聚合酶链式反应扩增，得到扩增产物，并对该扩增产物进行电泳分离，得到不同品种白芍的DNA电泳图，以该电泳图的谱图信息建立白芍品种鉴别模型；品种鉴别：取待测白芍，按照上述方法得到其DNA电泳图，将该待测白芍电泳图的谱图信息代入上述鉴别模型中进行分析，判定得到该白芍的品种。该方法为白芍品种的区分提供了有效可靠的鉴定手段。相对于传统形态鉴定具有巨大优势，在白芍药材的研究和应用中，为解决品种混乱和品种优劣问题提供了一种新的手段。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105018614
【申请号】CN201510423176
【发明人】胡珊, 王永辉, 连林生, 张健, 陈洪毅
【申请人】广州市香雪制药股份有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月17日