白芍的引种和培育工作提供了技术支持。且该方法具有快速简便，只 需要少量样本即可实现的特点，可以鉴别白芍种苗的品种，从而可从基因水平选择种植品 种，从源头上保证药材的质量。
[0037] 并且，本发明还通过大量实验筛选出最具代表性的引物，以及适宜的实验条件，提 高了该检测方法的准确性、稳定性和重复性。
【附图说明】
[0038] 图1为实施例1中对照品白芍的聚类树形图；
[0039] 图2为实施例1中对照品和待测品白芍的聚类树形图。
【具体实施方式】
[0040] 以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明解释，但并不对本发明造成任何 限制。
[0041] 以下实施例中的实验仪器和试剂如下：
[0042] 仪器：核酸蛋白测定仪（Implen Nanophotometer)、PCR扩增仪（BIO-RAD)、高速离 心机（Eppendorf 5418)、超低温冰箱（Thermo 902-ULTS)、电泳仪、电泳槽（BIO-RAD)、凝胶 成像系统（Bio-Rad)。
[0043] 试剂：Taq DNA 聚合酶（Promega，5U/ μ L)、dNTP (Promega，IOmM)、DNAmarker (广 州东盛生物科技有限公司）、10XLoading Buffer(Takara)、琼脂糖（Biowest)、Golden View (北京博凌科为生物科技有限公司）。
[0044] 实施例1
[0045] 一种白芍品种检测方法，包括以下步骤：
[0046] 一、建立鉴别模型。
[0047] 1、取不同品种的白芍对照品，采挖的对照品种类为4年生有性繁殖白芍和4年生 无性繁殖白芍。
[0048] 有性繁殖白芍为沪谯公司十八里种植基地所栽样品，是从山东引进的品种，一共5 棵，分别标记为基地1号、基地2号、基地3号、基地4号、基地5号。
[0049] 无性繁殖白芍为十八里散户种植地的样品，芽头繁殖的亳州本地品种白芍，一共5 棵，分别标记为1号、2号、3号、4号、5号。
[0050] 2、提取上述已知品种的白芍基因组DNA。
[0051] 分别称取0. 2g白芍种苗嫩叶置于预冷的研钵中，加入液氮研磨成细粉，迅速转移 至2mL离心管中；加入65°C预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵）缓冲液800 yL，65°C水浴 30分钟；冷却至室温，加入800 μ L的氯仿：异戊醇（24:1)混合溶液并充分混匀，12000rpm 离心15分钟；取上清液至一 I. 5mL离心管中，加入50 μ L NaAc，ImL无水乙醇，充分混勾， 12000rpm离心5min，弃上清；加入ImL体积百分浓度为70%的乙醇溶液洗涤DNA沉淀，并 将DNA沉淀于室温晾干，晾干后加入100 μ L TE充分溶解，于-20°C保存备用，用1 %琼脂糖 凝胶电泳和紫外分光光度法检测基因组DNA的质量和浓度。
[0052] 3、分别将上述所提取的基因组DNA用以下引物进行聚合酶链式反应。
[0053] 引物序列表
[0066] 引物 13 :CACACACACACACACARC
[0067] 注：R代表A或T，Y代表C或G
[0068] 其中：聚合酶链式反应体积为25 μ L。反应体系成分为：2. 5 μ L IOXbuffer缓冲 液（即DNA凝胶加样缓冲液），2. 0 μ L浓度为25mmol/L的MgCl2,0· 5 μ L浓度为lOmmol/L 的dNTPs，0. 75 μ L浓度为10 μ mol/L的引物，上述得到的DNA模板50ng，0. 3 μ L浓度为5U/ μ L的DNA聚合酶，剩余体积用超纯水补足25 μ L。
[0069] 反应循环参数为：95°C，5分钟；随后95°C，45秒；51~58°C退火，45秒；72°C，90 秒，35个循环；最后72°C延伸，10分钟。
[0070] 4、用琼脂糖凝胶电泳分别对聚合酶链式反应产物进行电泳分离
[0071 ] 用I X TAE缓冲液配置1 %琼脂糖200mL，摇匀溶化，用微波炉煮沸至澄清透明。在 热胶中加入Golden View 8. 3 yL摇勾，待自然冷却至50°C左右，灌胶于插好样品梳的电泳 槽中制板。凝胶完全凝固后，小心取出梳子。将凝胶放入电泳槽内，加样孔一侧靠负极，加入 适量的TAE工作缓冲液，使其液面恰好没过胶面约Imm深。用移液器将10 X loading buffer 混合的样品DNA和分子量标准（Marker)从点样孔分别垂直加入点样孔中。加样完毕后，正 确连接电泳槽和电源，电泳电压180V，电泳0. 5h后至指示剂溴酚蓝距底端约2cm时取出凝 胶板，在凝胶分析系统上进行分析，照相存盘。
[0072] 5、建立白芍品种鉴别模型。
[0073] 对重复性好且条带清晰的电泳条带计数，每条DNA谱带作为一个单位，有条带记 为1，无条带记为〇,得到〇、1矩阵数据，以1、〇矩阵输入NTSys软件，算出各样品之间的相 似系数，如下表1所示，并采用UPGM算法进行各品种间聚类分析，如图1所示，构建聚类树 形图，得到白芍品种鉴别模型。
[0074] 表1已知品种白芍之间的相似系数
[0076] 二、品种鉴别
[0077] 1、取下述表2待测样品。
[0078] 表2白芍采样情况表
[0079]
[0080] 2、按照上述方法，提取得到其DNA电泳图，按照上述电泳条带计数方法，得到0、I 矩阵数据，算出各样品之间的相似系数，如下表3所示，并采用UPGM算法进行各品种间聚 类分析，如图2所示，构建聚类树形图，待测种苗样品在聚类分析图中与哪种对照品聚为一 大类，即可认为待测样品与该种对照品为同一品种的白芍。
[0081] 表3各样品白芍之间的相似系数
[0084] 三、检测结果。
[0085] 由聚类分析图1可知，引进品种白芍对照品基地1号-基地5号聚为一大类，亳州 本地品种白芍对照品1号-5号聚为一大类，与采样情况一致。
[0086] 由聚类分析图2可知，样品SN8、SN9、SNlO (即十河采集的三个样本）与对照品基 地1号、基地2号和基地3号聚为一大类，为引进品种白芍；样品SN1、SN2、SN3、SN4、SN5、 SN6和SN7(即十八里采集的三个样本、十九里采集的三个和十河采集的一个样本）与对照 品1号、3号、4号聚为一大类，为亳州白芍本地品种。
[0087] 从上述结果来看，采用本发明的方法可以简单快捷的鉴定白芍种苗的品种，解决 白芍种苗从外观难以鉴别品种的难题，为白芍的大规模种植提供重要的品种选育技术支 持。
[0088] 实施例2
[0089] 一种白芍品种检测方法，与实施例1的方法基本相似，不同之处在于：
[0090] 为了得到扩增产物，所采用的聚合酶链式反应体系成分为：
[0091] 聚合酶链式反应体积为25 μ L。反应体系成分为：2. 5 μ L IOXbuffer缓冲液（即 DNA凝胶加样缓冲液），I. 0 μ L浓度为25mmol/L的MgCl2,0. 3 μ L浓度为lOmmol/L的dNTPs， 〇· 5 μ L浓度为10 μ mol/L的弓丨物，上述得至Ij的DNA模板20ng，0· 1 μ L浓度为5U/ μ L的DNA 聚合酶，剩余体积用超纯水补足。
[0092] 将上述得到的扩增产物用用琼脂糖凝胶电泳进行电泳分离，与实施例1相比，电 泳条带少，且模糊，难以进行后续的聚类分析和相似系数的计算。
[0093] 实施例3
[0094] -种白芍品种检测方法，与实施例1的方法基本相似，不同之处在于：
[0095] 为了得到扩增产物，所采用的聚合酶链式反应体系成分为：
[0096] 聚合酶链式反应体积为25 μ L。反应体系成