一种单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及抗猪圆环病毒2型单克隆抗体、含该单克隆抗体的药物组合物、抗体检 测试剂盒、抗原检测试剂盒等应用，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒（Circoviridae，Circovirus，Porcine circovirus，PCV)是迄今发现 的一种最小的动物病毒，病毒直径约17nm，环状，单股DNA病毒，具有两个血清型即PCVl和 PCV2。其中，PCVl没有致病性；PCV2具有致病性，可引发一系列猪圆环病毒病（Porcine Circovirus diseases，PCVD)包括断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystcmic Wasting Syndrome，PMWS)、仔猪A2型先天震颤(A2CT)、猪繁殖障碍、猪皮炎 肾炎综合征(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)和呼吸道疾病综合征(PRDS)，特别是PMffS的主 要病原。PMWS主要侵害6-8周龄的仔猪，发病率一般为10 %-20 %，病死率高达50 %-100%， 并能造成免疫抑制降低抗病力;成年猪一般为隐性感染，不表现任何症状，但可以传染给仔 猪。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展，给许多国家和地区带来了巨大的损失。
[0003] 目前，PCV2抗体的检测方法包括免疫过氧化物酶单层试验（IPMA)、间接免疫荧光 试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)，但IPMA、IFA不能区分PCVl和PCV2的抗原交叉反应， 且操作复杂，耗时耗力；现有ELISA试剂盒包括国外试剂盒(荷兰Biochek公司的PCV2ELISA SKl 05、韩国金诺公司的PCV2ELISA)和国内试剂盒（以间接ELI SA抗体检测试剂盒为主，如中 国动物卫生与流行病学中心的PCV2ELISA抗体检测试剂盒、浙江大学的PCV2-dCap-ELI SA抗 体检测试剂盒），这些试剂盒均不能区分PCVl交叉抗体的问题。
[0004] 临床上，PCVl与PCV2经常混合感染，虽然PCVl不会引起发病，但会交叉干扰PCV2感 染的检测。免疫学试验表明，PCVl病毒与PCV2病毒有明显发交叉反应。因此，检测PCV2感染 的关键技术在于如何尽可能地排除PCVl的干扰，减少假阳性结果。鉴于此，为了更为准确地 检测PCV2,亟需建立一种检测方法。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种抗猪圆环病毒2型单克隆抗体及其 应用，该单克隆抗体可用于检测猪圆环病毒2型抗体、抗原，还可以预防和/或治疗猪圆环病 毒病。
[0006] 本发明涉及一种特异性结合猪圆环病毒2型的单克隆抗体PCV2_McAB2的可变区序 列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或 多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸 序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或 修饰保守性突变获得的保守性变异体。
[0007] 本发明还涉及具有上述可变区序列的抗体或其片段，所述抗体或其片段仍保持特 异性结合猪圆环病毒2型的能力。
[0008] 本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包括免疫量的含有所述单克隆抗 体PCV2-McAB2可变区序列的抗体或所述抗体片段，以及药学上可接受的载体。
[0009] 本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪圆环病毒2型感染相关疾 病的药物中的应用。
[0010] 本发明还涉及一种抗体检测试剂盒，所述抗体检测试剂盒包括有效量的具有所述 单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的抗体或所述抗体片段，猪圆环病毒2型抗原，以及用 于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
[0011] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环 病毒2型单克隆抗体PCV2-McABl和/或有效量的具有单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列 的抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、 阴性对照、阳性对照;其中，所述单克隆抗体PCV2-McABl为2F8或3G12。
[0012] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括抗猪圆环病 毒2型单克隆抗体PCV2-McABl和/或有效量的具有单克隆抗体PCV2-McAB2的可变区序列的 抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试 剂、阴性对照、阳性对照，其中，所述用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检 测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反 应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多抗、酶标羊抗鼠二抗。
[0013] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所 述单克隆抗体PCV2-McABl、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2 型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中，所述抗原检测试剂盒包括缓冲液供应单 元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测 试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包括硝酸纤维素膜(1 )，所述酶免疫层析检测试纸条在 纵向上依次包括底物供应区、样品供应区、检测区;所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸 附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并 在硝酸纤维素膜（1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫 (2)，其上吸附有酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述酶底物能与所述单克隆抗体 PCV2-McAB2上标记的酶产生显色反应，所述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜（1)接触，所述单克 隆抗体PCV2-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液供应单元的远端 迀移；以及所述检测区固定化有所述单克隆抗体PCV2-McABl;其中，所述缓冲液供应单元包 括展开液垫(5 )、底物缓冲液槽(8 )、底物缓冲液(9)和缓冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置 于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲液槽(8)的上方，按下可将所述展开 液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括一条检测线(6)、一条质控线(7)，其中，所述质 控线(7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗 体PCV2-McABl，在所述质控线（7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫 (2)上的酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2对于固定在检测线(6)上的所述单克隆抗体 PCV2-McABl而言是过量的；所述硝酸纤维素膜（1)全段粘附在所述支撑物（10)上，支撑物 (10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检测区以及吸水垫(4)，所述吸水 垫(4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品（11)加入的位置为所述酶标垫(2) 的位置。
[0014] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所 述单克隆抗体PCV2-McABl、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2 型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中，所述抗原检测试剂盒包括胶体金检测试 纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端 向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素 膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体 能在其上向底板第二端迀移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括一条检测线和一条质控线，所述 检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McABl，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗 鼠多抗。
[0015] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所 述单克隆抗体PCV2-McABl、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2 型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂;其中，所抗原检测述试剂盒包括荧光免疫检测 试纸条，所述荧光免疫检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第 一端向第二端的方向上依次由滤纸、样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤 维素膜与荧光垫接触或与样品垫、荧光垫接触使得与抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的 结合体能在其上向底板第二端迀移;所述荧光垫上含有荧光标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单 克隆抗体PCV2-McAB 1，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0016] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括包被所述单 克隆抗体PCV2-McABl的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、对猪圆环 病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。
[0017] 本发明还涉及一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括包被猪圆环 病毒2型抗原的ELISA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止 液、阴性对照、阳性对照；其中，含所述单克隆抗体的反应液为含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PCV2-McABl与PCV2-McAB2的混合反应液。
[0018] 本发明还涉及所述抗原检测试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测 中的应用。
[0019] 本发明的有益效果:含本发明单克隆抗体PCV2-MCAB2的抗体检测试剂盒不与PCVl 抗体交叉反应，降低了假阳性检出率，同时相对于IPMA、IFA等需要花费4-5天的检测方法， 该检测方法花费2小时，缩短了检测时间;含本发明单克隆抗体PCV2-McAB2的抗原检测试剂 盒可用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测中的应用，减少了假阳性结果;含本发明的 抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的药物组合物可解决母源抗体不足时所引发的猪圆环病毒感 染的问题，可弥补现有疫苗预防效果不能达到100%的缺陷，解决了现有疫苗、母源抗体不 足时所引发的仔猪猪圆环病毒2型感染问题;单克隆抗体PCV2-McAB2具有中和病毒的活性， 能够用于相关联苗的鉴别检验。
【附图说明】
[0020] 图1为单克隆抗体3H11的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图，其中泳道M为蛋白Marker; 泳道I、2均为单克隆抗体3H11，包括上端的重链和下端的轻链。
[0021]图2为酶免疫层析检测试纸条的侧面示意图，图中：1_硝酸纤维素膜，2-酶标垫，3-底物垫，4-吸水垫，5-展开液垫，6-检测线，7-质控线，8-底物缓冲液槽，9-底物缓冲液，10-支撑物，11-检测样品。
【具体实施方式】
[0022]以下，对本发明的实施方式进行说明。
[0023] 术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个 体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语"单克隆"是指该抗体的性质不 是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合 抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗 原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因 子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体 的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类;也可以是包含抗原结 合结构域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1 ;和双链抗体((1丨3130(1丨68)。融合至另一多肽的、包 含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产 生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋 白可变区或互补性决定区（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区， 参见EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细 胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发 明的"单克隆抗体"也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本 领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增 得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体 中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人 员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接 在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两