[0083]作为本发明的一种实施方式，本发明提供了使用本发明的所述单克隆抗体PCV2-McABl和所述单克隆抗体PCV2-McAB2进行夹心法检测的试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环 病毒2型检测中的应用。
[0084] 本发明还涉及所述抗原检测试剂盒在用于非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测 中的应用;所述非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原检测包括流行病学分析、对离体组织进行 检测以及定性和定量鉴别检验含猪圆环病毒2型和其他抗原的疫苗组合物中的猪圆环病毒 2型抗原的检测。
[0085] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0086]本发明中抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3G12由小鼠骨髓杂交瘤细胞3G12株 (Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0，Strain3G12)分泌产生，其中小鼠骨 髓杂交瘤细胞3G12株的保藏号为CCTCC N0:C2014198,保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年11月3日。
[0087] 本发明中抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8由小鼠骨髓杂交瘤细胞2F8株 (Hybridoma-Balb/c mouse spleen cells and Sp2/0,strain 2F8)分泌产生，其中小鼠骨 髓杂交瘤细胞2F8株的保藏号为CCTCC N0:C2014199,保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2014年11月3日。
[0088] 本发明实施例中猪圆环病毒2型PCV2SH株已经在专利申请CN101240264A中公开， 猪圆环病毒1型PCVlG株已经在专利申请CN101423836A中公开。
[0089]本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS，其IL体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HP〇4.12H20 2.9g、KH2P〇4 0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不 构成对本发明的限定。
[0090] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说 明，均为常规方法;所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0091] 实施例1抗猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验
[0092] I. lPCV2Cap全蛋白的制备、纯化及含量测定
[0093]根据NCB I(http://www .ncbi.nlm.nih.gov)中报道的猪圆环病毒 2 型 PCV2-Nanjing株（登录号为KF524259.1 )中Cap全蛋白的基因序列设计引物对Cap-F: 5' CATATGATGACGTATCCAAGGAGGC3 '，Cap-R: 5 ' CTCGAGTTAAGGGTTAAGTGGGGGGT3 '。按李廷栋(李 廷栋，轮状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达及其类病毒颗粒的体外组装，2009)文献的操 作方法原核表达PCV2Cap全蛋白，并通过离子交换层析方法进行纯化，使用12%SDS-PAGE进 行蛋白电泳鉴定，结果：所获蛋白分子量与预期相符。将纯化后的蛋白样品在IX PBS (pH7.4)中透析过夜，透析后样品按照碧云天BCA蛋白定量试剂盒说明书进行定量，结果表 明PCV2-Cap全蛋白2的浓度为2mg/ml。
[0094] 1.2单克隆抗体2F8、3G12、3H11的制备和纯化
[0095]将0.5ml PCV2-Cap全蛋白与等量的弗氏佐剂经充分乳化后免疫与所用骨髓瘤细 胞同源的6-8周龄BALB/c健康小鼠2只，每只皮下多点注射乳化后的猪圆环病毒2型Cap全蛋 白300μ1，间隔2周加强一次，加强免疫使用弗氏不完全佐剂；用间接ELISA法测定其抗血清， 血清效价达到1:20000后方可融合。
[0096] 间接ELI SA方法包括:包被，以20mmo 1/1、pH9.6的碳酸盐缓冲液将猪圆环病毒2型 Cap全蛋白1:4000V/V稀释，包被96孔聚乙烯板，然后用洗涤液洗涤，拍干后，在4°C下真空抽 干，其中聚乙烯板包被规格为200μ1/孔，洗涤采用0.05%的Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤3 次;封闭，每孔加入pH为7.4内含10 % (V/V)小牛血清的磷酸盐缓冲液200μ1，在37°C下封闭2 小时，然后洗涤1次;加样，每板设阴性对照、阳性对照及磷酸盐缓冲液空白对照，每孔加入 第三次免疫后的第3天的1:5000(V/V)稀释后小鼠外周血清50μ1，在37°C下孵育1小时，洗涤 3次，每孔加入酶标羊抗鼠二抗100μΙ，在37°C下孵育1小时，洗涤3次;显色，每孔加入底物显 色液A和底物显色液B的混合液100μΙ，室温下反应15分钟，然后使用终止液终止反应;比色， 以空白调零，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值;结果判断，Ρ/Ν =测定标本OD均值/阴 性血清OD均值，P/N 2 2.1为阳性。
[0097] 分离脾细胞:取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺96孔培养板，将换液后 15小时的Sp2/0细胞调整为2 X IO7个/毫升细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬 液。
[0098] 细胞融合:将处于对数期的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按细胞数10:1比例混 合，加入PEG-1500使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养 液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml，以HAT选择培养基按36%的孔为1个细 胞/孔进行细胞培养。
[0099] 筛选杂交瘤细胞:待融合的细胞培养至第7天时，即细胞培养至覆盖10%孔底时， 吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用间接ELISA法检测抗体含量，经有限 稀释进行三次亚克隆筛选，依抗体的分泌情况筛选出高效价、高特异性的细胞株，扩大培 养，并将高效价、高特异性的细胞株冻存。最终筛选出三株小鼠骨髓杂交瘤细胞株。
[0100] 腹水的制备、纯化:选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用液体石蜡对小鼠腹腔注 射，两周后将5X IO5杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，在接种一周后收集小鼠的腹水，每只小 鼠可收集5ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪及DE-52离子交换柱将小鼠 IgG单克隆抗体腹水 纯化。
[0101] 最终获得3株小鼠骨髓杂交瘤细胞2?8、3612、3!111株，其中小鼠骨髓杂交瘤细胞 2F8株的保藏号为CCTCC NO:C2014199，其分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8;小鼠骨髓 杂交瘤细胞3G12株的保藏号为CCTCC N0:C2014198,其分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体 3G12;小鼠骨髓杂交瘤细胞3H11株分泌抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3H11。
[0102] 1.3单克隆抗体2F8、3G12、3H11类型和亚类的鉴定
[0103] 将单克隆抗体的细胞培养上清分别加入包被有抗鼠重链或轻链抗体的酶标板，50 ul/孔，每个样品加8孔。按照Koenig R. (Koenig R. Indirect ELISA methods for the broad specificity detection of plant viruses(J).Journal of General Virology, 1981，55(I): 53-62)文献中的间接ELISA法，每孔分别加入稀释的HRP-山羊抗鼠以1(册卩-IgM)、HRP-山羊抗鼠 IgGI (HRP-1gGI)、HRP-山羊抗鼠 IgG2a (HRP-1gG2a)、HRP-山羊抗鼠 IgG2b(HRP-IgG2b)和HRP-山羊抗鼠 IgG3(HRP-Ig G3)抗体酶标二抗，结果见表1。
[0104] 表1各单克隆抗体类型的鉴定
[0106] 注:+表示阳性，-表示阴性。
[0107] 由表1可知，单克隆抗体2F8、3H11的亚类为IgG2a，单克隆抗体3G12的亚类为 IgG2b。
[0108] 1.4单克隆抗体2?8、3612、3!111特异性的鉴定
[0109] 将纯化的单克隆抗体分别加入猪圆环病毒2型PCV2SH株、猪圆环病毒1型PCVl、猪 瘟病毒CSFV C株、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV JXAl-R株、猪伪狂犬病病毒PRV Bartha K-61株、猪细小病毒PPV WH-I株感染的细胞，固定后，加入FITC标记的羊抗鼠二抗，置荧光 显微镜观察。测定单克隆抗体3H11与？(^1工3?￥、？1??￥、？1^、？?￥是否具有交叉反应性。结 果：单克隆抗体2?8、3612、3犯1与？(^1工3?￥、？1?1?￥、？1^、？?￥接种细胞均未出现特异性荧 光，无交叉反应;而与PCV2接种细胞在细胞核及细胞质部位出现特异性荧光着染。表明：这 三株单克隆抗体均是抗圆环病毒2型的特异性单克隆抗体。
[0110] 1.5单克隆抗体2?8、3612亲和力常数1((1的测定
[0111] 按照郭杰标(郭杰标等，以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究，南方医 科大学学报，2006,26(7): 1057-1059)文献中的竞争ELISA方法进行，分别测定单克隆抗体 2F8、3G12的OD45Q值以计算各个反应溶液的抗原结合率，并计算亲和力常数。分别计算单克 隆抗体2F8、3G12的抗原结合率B/(l-抗原结合率B)，然后作图求得斜率(亲和力常数)分别 为4 · 10 X 10-12mol/l 和3 · 65 X 10-12mol/l。
[0112] 1.6单克隆抗体3H11相对亲和力的测定
[0113] 将单克隆抗体3H11按照宋帅等(宋帅，林彤，邵军军，常惠芸.抗0型口蹄疫病毒单 克隆抗体相对亲和力的测定.兽医免疫学，2009，25(4): 333-335)中的操作方法测定其相对 亲和力。其中抗原的包被浓度为2μg/ml，酶标二抗的稀释度为1:10000,测定纯化后的单克 隆抗体3H11的相对亲和力。结果:单克隆抗体3H11的相对亲和力为7 · 81ng/ml。
[0114] 1.7纯化单克隆抗体2?8、3612、3!111的检验
[0115] 外观检验:室温下，肉眼观察可见纯化的单克隆抗体2F8、3G12、3H11呈无色澄清状 态，均未见絮状物沉淀。
[0116] 无菌试验:按二〇一〇年版《中国兽药典》附录42进行检验，结果表明：纯化后单克 隆抗体2?8、3612、3!111均无菌。
[0117] 1.8单克隆抗体2?8、3612、3!111的纯度
[0118] 对纯化后的单抗进行纯度的检测，使用12%SDS-PAGE蛋白电泳法，每泳道的上样 量为l〇yg，检测结果表明：单克隆抗体2F8、3G12的纯度均不低于80%，单克隆抗体3H11的纯 度不低于90%。
[0119] 1.9单克隆抗体2?8、3612、3!111效价的测定
[0120] 按照实施例1.2测定单克隆抗体2F8、3G12的ELISA效价，结果分别为1:40000、1: 45000。按刘长明等(刘长明，张超范，危艳武.猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验 抗体检测试剂盒的研究与应用.中国预防兽医学报，2007,29(8):621-624)的免疫过氧化物 酶单层细胞试验（IPMA)方法进行效价测定，单克隆抗体2F8、3G12、3H11的IPMA效价均不低 于I:10240。
[0121] 1.10单克隆抗体2F8、3G12、3H11含量的测定
[0122] 用BCA蛋白定量试剂盒（购自Pierce公司）按照说明书对纯化后单克隆抗体2F8、 3G12、3H11分别进行定量分析，测定结果表明：单克隆抗体2F8、3G12、3H11的蛋白含量分别 为2·80、3·20、3·25mg/ml。
[0123] 1.11单克隆抗体3H11中和活性的测定
[0124] 将单克隆抗体3H11用I3BS作10倍系列稀释，将各稀释度单克隆抗体与200TCID5〇的 PCV2SH株于37°C作用2小时，分别接种长满单层的PK-15细胞，每个稀释度接种3孔，37°C、 5%C02下培养72h，试验中设立阳性对照和阴性对照。用IPMA方法检测，每孔选择5个视野， 记录每个视野中的阳性细胞数，以相对于未中和的阳性对照，待检孔中阳性细胞数减少大 于90%判为有中和能力。以能中和病毒的单克隆抗体的最高稀释倍数作为单抗的中和效 价。结果，单克隆抗体3H11中和抗体效价不低于1:10 4·5。
[0125] 1.12单克隆抗体3H11可变区序列的测定
[0126] 根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：
[0127] Pl:5，-GTGAAGCTGGTGGAGTCTGG-3 '
[0128] P2:5 '-TGCAGAGACAGTGACCTGAG-3 '
[0129] 设计轻链可变区引物序列：