一种高纯度和高活性血管性血友病因子的制备工艺的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种从人血浆冷沉淀提取凝血因子珊的废料中提取人血管性血友病因子的制备工艺，特别涉及一种高纯度和高活性血管性血友病因子的制备工艺，属于生物制药领域。【
背景技术：
】[0002]VWF是一种具有多聚体的血浆糖蛋白，其分子量从250kDa到2千万kDa不等，形成血浆中已知的最大分子量可溶性蛋白。血浆中小分子量vWF主要是二聚体形式，分子量约500kDa。大小不等的多聚体，对维持vWF正常生物活性具有重要意义。[0003]血浆vWF在原发性止血中起着重要作用，其负责血小板与受损伤血管表面的粘附，并因此形成血小板栓子，有助于纤维蛋白交联的形成。另外，血浆vWF起着凝血因子VIII的运输剂和稳定剂的作用。[0004]血管性血友病（vWD)是最常见的遗传性出血性疾病，患者vonWillebrand因子(vonWillebrandfactor，vWF)基因突变或调控异常导致血浆vWF数量减少或质量异常。vWD临床特征主要为皮肤黏膜出血，2N型和3型患者还可发生与血友病A相似的关节腔出血和肌肉血肿。据国外报道，vWD发病率(2.3~11.0)/10万人口，一般认为在遗传性出血性疾病中，vWD居第二位。[0005]临床上vWF的活性用瑞斯托霉素辅因子活性(vWF:RC〇)来表征，主要用于治疗先天性、获得性血管性血友病(vWD)，一般以20~60UvWF:RCo/kg剂量来给药。[0006]研究表明冷沉淀中富含vWF等凝血因子类物质。在血浆原料日趋紧缺的今天，通过冷沉淀来制备vWF，对冷沉淀的综合利用，节约稀缺血浆资源，提高市场竞争力具有重大意义。[0007]现有技术中，较早的工艺使用vWF的抗体偶联到琼脂糖凝胶上，通过免疫亲和层析纯化vWF，但其抗体制备周期长，凝胶载量低，不适合作大规模制备，如《PurificationofvonWiIlebrandFactorsolutionsusinggelpermeationchromatography》（UP4774323)〇[0008]有专利用DEAEFractogelTSK650M(Merck)纯化vWF因子组分，纯度高，但是工艺比较复杂，需要两步离子交换和一步亲和层析，如《Processforanindustrial-scalepreparationofastandardizedhumanvonWillebrandfactorconcentrateofveryhighpurityandsuitablefortherapeuticuse》（US5408039)。也有报道CHT层析结合PH5.4酸沉淀分离vWF组分的，其比活不高，且酸沉淀去除纤维结合蛋白的同时，可能影响vWF的生物学活性，如《Productionofavonwillebrandfactorprepartionhavingagreatspecificactivity))(US20070135619A1)〇[0009]另外还有一些工艺用EMDFractogelTMAE(Merck)来纯化VIII/vWF因子复合物，但是都无法单独得到高纯度的vWF，治疗针对性不强，如《具有止血活性的含有vWF的制剂及其制备方法》（CN1425024A)，《AProcessforrecoveringahigh-purityvirus-inactivatedfactorVIIIbyanionexchangerchromatography))(US5714590)。[0010]还有一些公司用基因重组的方法(猴肾细胞或CHO细胞)纯化vWF，他通过阴离子交换层析法从动物细胞培养液中进行提纯，但是由于动物原性抗原的存在，人体对其可能有排斥作用，如《MethodforisolationofhighlypurevonWillebrandFactorKUS5854403)。[0011]另有采用两步层析法纯化制备vWF的报道，但其纯度不高，比活相对较低，仅50IU/mg，如〈〈ProcessformanufacturingvonWiIlebrandfactor))(US5252710)〇[0012]可见，现有的的vWF纯化工艺仍存在一些问题：（I)制备周期长，不适应于大规模制备，尤其是采用免疫亲和层析法纯化时，其抗体制备周期长，凝胶载量低。（2)VIII/vWF复合物产品在较难控制工艺稳定性；（3)重组方法所得vWF产品可能存在异质抗原；（4)分离纯化工艺繁琐。[0013]目前，血管性血友病可用冷沉淀、VIII/VWF因子复合物和DDAVPd-去氨基-8-D-精氨酸加压素)治疗，但针对性不强，更纯的vWF因子可专一性治疗各种类型的血管性血友病，与前几种方法比有较大优势。【
发明内容】[0014]本发明的目的在于提供一种高纯度和高活性血管性血友病因子的制备工艺。[0015]本发明的主要技术构思如下：[0016]本发明对经层析后的蛋白液在层析缓冲液中加入甘氨酸保护vWF活性;优选层析后冻干前的蛋白液中加入赖氨酸、甘氨酸和白蛋白作为冻干保护剂，保护vWF活性;优选层析缓冲液中甘氨酸质量浓度0.6%~1%，冻干保护剂中赖氨酸质量浓度2~3%，甘氨酸质量浓度0.2%，白蛋白质量浓度0.8~1.3%。[0017]本发明于S/D病毒灭活前优化添加2%氢氧化铝凝胶进行吸附去除11，11、^、乂因子;S/D灭活前串联过滤使用的滤芯尺寸为1.Ομπι和0.45μηι的滤芯。[0018]本发明用一步Q-Sepharose阴离子交换层析及一步亲和层析纯化得到纯度较高的vWF。即收集冷沉淀提取凝血因子VI的废料即在冷沉淀提取凝血因子VI的制备中经层析柱流出来的液体作为原料;通过Q-Sepharose离子交换柱层析后，收集洗脱液，再经明胶亲和层析，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，得到血管性血友病因子。[0019]本发明的制备工艺中：[0020](1)通过调整洗涤缓冲液B和洗脱缓冲液B中的盐浓度;采用Q-Sepharose柱层析法去除纤维蛋白原和纤维结合蛋白及其它杂蛋白；[0021](2)经Q-Sepharose柱层析后的洗脱液，再经明胶层析，通过调整洗脱缓冲液B和透析液的盐浓度，去除残余的纤维结合蛋白及杂质，即得含高纯度vWF的流穿液。[0022]本发明的制备工艺，它依次包括:冷沉淀溶解、2%氢氧化铝凝胶吸附、调节离子强度、串联过滤、S/D病毒灭活、离子交换层析;离子交换层析得收集洗脱液，洗脱液经超滤、透析、过滤，用于凝血因子VIII的生产，再从冷沉淀提取凝血因子VI的废料即收集经层析柱流穿出的液体中提取vWF;Q-Sepharose阴离子交换层析、明胶亲和层析、除菌过滤分装、冷冻干燥、干热灭活。离子交换层析流穿液收集后，先浓缩一倍，再用洗涤缓冲液B等体积超滤6次，再经Q-Sepharose层析柱，用洗脱缓冲液B收集洗脱下来的蛋白液。[0023]本发明是这样来实现的，其具体工艺方案如下：[0024](1)检疫期检疫合格的人血浆领取后，75%乙醇擦拭血浆袋表面，用注射用水冲洗，合并到融浆罐中，用30~35°C以下循环水融化，血浆温度控制不高于4°C;待融化后，离心，出液温度控制在0~4°C，收集冷沉淀；[0025](2)将步骤（1)的制得物加入3IU/ml肝素钠溶液中，搅拌至冷沉淀完全溶解，循环水的温度控制在28~37°C;开始离心，收集上清液，称重；[0026](3)将步骤(2)的制得物上清液用lmol/L盐酸调节PH至6.0~7.0;加入2%氢氧化铝凝胶，搅拌;开始离心，收集上清液，称重；[0027](4)按"W(离子强度缓冲液）=上清液重量/10"计算，称取计算量的离子强度缓冲液至步骤(3)的制得物上清液中；调节上清液PH至6.0~7.0;用蛋白浓度缓冲液调节蛋白浓度不大于l〇g/L;用1.Ομπι的滤芯过滤，收集过滤液，称重；[0028](5)按步骤(4)的制当前第1页1 2 3