专利名称：人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人源化抗人血管性血友病因子(von ffillebrand Factor, vffF)Al 区的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
血栓栓塞所引起或并发的病变，是最常见的死亡病因之一。随着社会的发展和人 口老龄化的进程，以及饮食及生活方式改变等因素的影响，血栓栓塞性疾病的发病率逐年 增加，给社会，家庭及个人带来了巨大的损失和痛苦。在心脑血管疾病中，血栓性疾病位居 发病率、致残率和死亡率之首，抗血栓药物也因此而成为目前心脑血管药物市场增长最快 的一类药物。治疗血栓性疾病的抗血栓药物主要分为抗血小板、抗凝血酶和溶血栓药物三大 类。如以华法林(Warfarin)为代表的肝素类产品干扰凝血因子，阻止血液凝固。组织型纤 溶酶原激活物(t-PA)、链激酶(SK)和尿激酶(UK)等溶栓药可激活纤溶酶，分解纤维蛋白而 使血栓溶解。抗血小板药具有抑制血小板的粘附、活化和聚集的功能，从而阻碍血栓形成。 尽管在抗血栓药物市场上，目前已有足够的治疗药物，但它们都各自存在着较大的缺点。例 如，氯吡格雷治疗效力较低，服用华法林需要掌握严格的剂量以保证安全，溶栓药物常引起 出血以及使用后栓塞的再形成。现有抗血栓药物的这些缺陷，使得新一代抗血栓药物的研 究和开发显得很有必要。正常情况下，体内止血、凝血系统与纤溶系统处于生理性平衡，保持正常血流状 态。但在一些病理情况下，如血管内膜损伤或静脉血流阻滞时，血液便可在心血管腔内凝 固，形成血栓。研究表明，血小板粘附到血管壁是血栓形成的第一步。胶原蛋白I型、III 型、血管性血友病因子(von ffillebrand factor，简称vWF)，血小板受体糖蛋白GPIb是血 小板和血管壁粘附的主要分子，其中vWF通过结合血小板表面的GPIb和血管表面的胶原蛋 白来介导血小板对血管壁的粘附。动物实验结果显示，vWF或者GPIb的拮抗剂，无论是抗 体，多肽，还是蛇毒蛋白，即能有效的阻止血小板对血管壁的粘附，进而抑制血栓的形成，又 能有效克服现有抗血栓药物存在的出血、血小板减少等副作用。因此，启动血小板-血管壁 粘附的功能蛋白vWF和GPIb被认为是研发新一代抗血栓药物的理想靶标。vWF主要由血管内皮细胞合成，其单体分子量为250KD左右，但一般以超过1000KD 的聚合体形式存在，主要分布于血浆、基底膜、内皮细胞和血小板a颗粒内。vWF有六个重 要的结构域，分别与VIII因子、血小板膜糖蛋白lb (GP Ib)、GP Ilb/IIIa、肝素、胶原及其 它基质蛋白质结合，发挥重要的生理作用。血管受损后，血浆中的vWF通过其A3区结合内 皮下暴露的胶原，通过A1区与GP lb结合，介导血小板粘附于血管受损部位，最终导致血小 板活化、聚集，及血栓的形成。用vWF作为分子靶标的抗血栓药物，由于抑制血栓形成的第 一步，从理论上推测，其抗血栓效果要比现有药物更强。早在1991年，日本奈良医科大学的 Fuj imura等制备的鼠单克隆抗体NMC-4，识别vWF的A1区，在10ug/mL的浓度下可以完全抑 制瑞斯托霉素(ristocetin)或博托霉素(botrocetin)诱导的vWF和血小板的结合。1997年日本横滨中央研究室和Ajinomoto公司获得针对vWF因子A1段的鼠单克隆抗体AJvW-2， 以100mg/kg和300mg/kg的剂量注射豚鼠，可以有效抑制血栓形成且不导致出血时间的延 长。在高剪切力情况下，NMC-4和AJvW-2可以有效抑制血栓的生成以及原始血栓的继续生 长，表明vWF的抗体药物尤其适用于治疗动脉血栓而不引起过量出血。传统的杂交瘤技术产生的单克隆抗体直接用于疾病治疗的效果并不理想，其主要 原因在于鼠源抗体的免疫原性引起人体产生使其失效的中和抗体。解决这一问题的关键技 术之一抗体人源化技术即是在不改变鼠抗体的抗原特异性条件下，改变其分子组成使得含 有更多的人类抗体氨基酸序列。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有免疫原性低、抗血栓能力强而又不引起过量出血 的单克隆抗体，以用作预防和治疗血栓性疾病特别是动脉血栓疾病的人源化抗人血管性血 友病因子单克隆抗体。为达到此目的，本发明采用的主要技术方案是利用基因工程技术对没有专利保护 的鼠源抗体NMC-4进行改造，在维持其抗原特异性的基础上，使其主要氨基酸组成来自人 类抗体，从而降低其免疫原性，成为理想的临床药物。实现上述目的技术方案如下一种人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，包括有鼠抗体NMC-4的重链可变区，该重链可变区含有的⑶Rl(互补决定簇或高可变 区-complementarity determinative region, CDR)、CDR2 禾口 CDR3 的氛基酸序列依次如序 列号1、2和3所示；重链可变区的框架区氨基酸序列与人抗体胚系基因位点VH 4-59编码 的框架区相同；鼠抗体NMC-4的轻链可变区，该轻链可变区含有⑶R1、⑶R2和⑶R3、或含有⑶R2 和⑶R3、或含有⑶R3，且⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列依次如序列号4、5和6所示；轻 链可变区的框架区氨基酸序列与人抗体胚系基因位点VL 08编码的框架区相同，或轻链可 变区的框架区氨基酸序列与人抗体胚系基因位点VL 08编码的框架区相同，且其中第4节 框架区的氨基酸由Phe Gly Gli Gly突变为Phe Gly Gin Gly(FGGG突变为FGQG)。进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列如序列号7所示。编码所述重链可变区 的氨基酸序列的DNA如序列号9所示。优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列号8所示，即其包含有如序列号4、5 和6所示的⑶R1、⑶R2和⑶R3。编码所述轻链可变区的氨基酸序列的DNA如序列号10所示o本发明的另一目的是提供上述人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体的应用。具体技术方案如下上述的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体在制备预防和治疗人类血栓性 疾病的药物中的应用。优选地，所述人类血栓性疾病为动脉血栓类疾病。本发明对没有专利保护的鼠源抗体NMC-4进行人源化改造，制造出具有vWF结合 能力，抑制血栓形成，免疫原性低的一种新型人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，编 码该抗体或抗体片段的基因可以在不同的宿主细胞中表达和生产，包括但不限于哺乳动物细胞。本发明的单克隆抗体或抗体片段能够阻断vWF和GP Iba的相互作用，从而抑制血 小板的粘附和聚集，因此可用于制备预防和治疗多种血栓类疾病的药物，为预防和治疗人 类血栓性疾病特别是动脉血栓提供了一种可能。
图1显示人源化vWF抗体重链和含有一个或多个鼠源抗体轻链⑶R的人源化轻链 组成的全抗在不同浓度下抑制血小板聚集的情况；图2显示嵌合抗体及人源化抗体对人血小板聚集的抑制作用；图3显示人源化抗体对猴血小板聚集的抑制作用。
具体实施例方式本发明建立了一种新的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，具体构建步骤 如下(1)根据鼠源抗体 NMC-4(Fujumura 等，Blood. 77 =113-20,1991)重链和轻链可变 区的氨基酸序列确定其对应的框架区(FW)和高可变区(CDRs)；(2)利用鼠源抗体框架序列作为模板寻找同源的人胚系抗体可变区。根据高可变 区的长短，框架上特定位置的氨基酸性质，选择人胚系抗体框架；(3)移植鼠源抗体高可变区到所选人胚系抗体框架形成杂合抗体可变区，并与鼠 源抗体可变区比较，决定人胚系抗体框架区可能需要返回突变的氨基酸；(4)根据鼠源抗体与vWF Al区结合的表位及结构分析结果(Celikel等，Nat StructBiol. 5 189-94，1998)，确定其可变区氨基酸对结合抗原的贡献，在不影响抗原结合 能力及特异性的前提下，尽量用人胚系抗体可变区氨基酸取代鼠抗体可变区氨基酸；(5)应用化学合成、PCR、点突变等方法制备编码人源化抗体可变区及其变异体的 基因序列，连接人抗体IgGl或IgG4恒定区，并通过合适的载体在宿主细胞中获得表达；(6)应用vWF结合实验、血小板聚集实验等来确定人源化抗体的生物学功能。通过鼠源抗体和人胚系抗体氨基酸序列的同源分析，并考虑高可变区长度的一致 性，选择重链4-59基因位点作为人源化的框架，其同源性程度达70 %。采用同样的分析， 选择轻链08基因位点作为人源化的框架，其同源性程度达83%。为了获得人源化vWF抗 体，所有鼠源抗体的重链及轻链可变区的CDR分别取代人胚系抗体重链及轻链可变区相对 应的⑶R。编码人源化抗体重链的DNA序列是由4-59框架区和鼠源抗体重链可变区⑶R的 DNA序列组合而成。与之相同，编码人源化抗体轻链的DNA序列是由08框架区和鼠源抗体 轻链可变区CDR的DNA序列组合而成。人源化抗体重、轻链可变区基因通过化学合成法获 得，其⑶R的取代及某些氨基酸的改变则通过PCR来实现。人源化抗体重、轻链可变区基因分别克隆到重链恒定区及轻链恒定区表达载体 上，通过人源化抗体重、轻链共转染293F细胞进行分泌表达。用蛋白A亲和层析柱纯化后 的全抗体通过比浊法测定其抗人血小板聚集能力的强弱。与嵌合抗体比较，人源化抗体活 性弱的则需要进行返回突变，即所选择的4-59或08框架区中影响CDR和vWF Al结合的氨 基酸要再突变为原鼠源抗体框架区相对应的氨基酸。人血小板聚集实验的筛选结果表明(图1)，CDR移植后的人源化抗体具有与鼠源抗体相近的抑制血小板聚集的活性，无需进行返回突变。除此之外，含鼠源抗体轻链CDR3， CDR2和CDR3的人源化抗体也具有很好的抗血小板聚集活性，不含有轻链CDR3的抗体其抑 制血小板聚集的能力则大大减弱，这和轻链CDR3直接参与vWF Al结合的结构分析结果相 吻合。用富含人或恒河猴血小板的血浆所做的聚集实验结果显示(图2和3)，人源化抗 体(VH-VL7)具有与鼠源抗体相近的抑制血小板聚集的活性。本发明基于vWF和血小板受体GP Ib的结合是血栓形成的起始步骤，抑制其结合 将有效阻断血栓的形成，由此产生的药物能够起到预防和治疗的双重作用，优越于目前市 场上主要针对血栓形成后抗栓或溶栓的治疗药物。本发明利用晶体结构分析结果辅助抗体人源化设计，得到人源化程度高的抗体， 为快速和准确的实施抗体人源化提供了 一个成功的例证。实施例1 鼠抗体可变区与vWF Al区结合的结构分析PDB数据库中的vWF Al和NMC_4Fab复合物晶体结构表明Al区的第四个α螺旋 是结合抗体的主要部位，其中632和636位的精氨酸起到重要的作用。抗体重链可变区的 ⑶R2和⑶R3以及轻链可变区的⑶R3主要参与和Al的结合，因此在人源化的过程中保留重 链的三个CDR不变，而轻链的CDR则有很大程度的取舍，以求更高程度的人源化。实施例2 鼠源vWF抗体的人源化改造(1)通过比较NMC-4与人胚系抗体家族可变区的氨基酸序列，发现其重链可变区 的框架区与人胚系抗体基因4-59编码的氨基酸序列有很高的同源性，且CDR的长度也相 同，推测它们的可变区具有相似的空间结构，故选择人胚系抗体基因4-59的框架区作为人 源化抗体重链的框架区。用同样的方法，发现其轻链可变区的框架区与人胚系抗体基因08 编码的氨基酸序列接近，故选择人胚系抗体基因08的框架区作为人源化抗体轻链的框架 区。(2)将鼠源抗体重链可变区的所有⑶R移植到4-59框架上，产生人源化的重链可 变区。重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID N0:7所示，重链可变区含有的⑶R1、⑶R2和 CDR3的氨基酸序列分别如:SEQ ID NO =USEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。重链可变区(SEQID NO 7)Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu ThrCys Thr ValSer Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asp (CDRl)Trp lie Arg Gln ProPro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn SerAla Leu Lys Ser(CDR2)Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser LeuLys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Ala AspTyr Gly Asn Tyr Asp Tyr Ala Leu Asp Tyr(CDR3)Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr ValSer Ser0该氨基酸序列可由SEQ ID NO :9所示DNA编码。将轻链可变区的⑶R3或⑶R2和⑶R3或⑶R1，⑶R2和⑶R3移植到08框架上， 产生人源化程度不同的轻链可变区，分别为VL2，VL4及VL7。尽管VLl (08)框架区3的73 位是苯丙氨酸，但大多数人胚系抗体轻链可变区框架区3的73位却是亮氨酸，因此，我们在 VL4和VL7中把73位改变为亮氨酸。同理，框架区4的第三位甘氨酸在VL7中改变为谷胱 酰胺。框架区4的谷氨酸-缬氨酸改为天冬氨酸_异亮氨酸是为了在该位置安插合适的克隆位点，以连接轻链恒定区。我们的实验已经证明，该改变对轻链的生物学功能没有影响。人源化的轻链序列如下 其中，VL7的轻链可变区(SEQ ID NO 8)Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr IleThr Cys Ser Ala Ser Gln Asp lie Asn Lys Tyr Leu Asp (CDRl)Trp Tyr Gln Gln Lys ProGly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser(CDR2) Gly Val ProSer Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln ProGlu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Lys Leu Pro Trp The (CDR3)Phe GlyGln Gly Thr Lys Val Asp lie Lys。该氨基酸序列由 SEQ ID N0:10 所 示的DNA所编码。(3)所述人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体的恒定区来自人IgGl 或者IgG4。用常规的分子克隆方法将人源化的抗体重链可变区连接到人IgGl的恒定区形成 全长的重链基因，人源化的抗体轻链可变区连接到人κ链恒定区形成全长的轻链基因。用 共转染的方法将携带重链和轻链基因的载体导入293F中，分泌表达全人源化抗体。所用的 IgGl携带L235E、E318A、K320A和K322A突变，其抗体依赖的细胞毒作用和激活补体的作用 大大减弱。这些点突变是用含有点突变的引物通过重叠PCR来实现的。所用的表达载体由 pCI-neo (美国Promega公司产品)改建而成，其分泌蛋白信号肽序列来自人的kappa轻链。实施例3 人源化抗体的表达与抗体活性检测(1)抗体的表达与纯化将293F细胞接种到293SFMII培养基(GIBCO)中，在含8 % CO2的培养箱中进 行传代悬浮培养，当培养密度达到10E6/ml时，可进行瞬时转染。将人源化抗体质粒用 OPTI-MEMI (GIBCO)稀释，用同样的培养基将PEI (P0LYSCIENCE)稀释，质粒与PEI以1 2 的质量比混合放置5分钟后滴加到悬浮细胞中，培养3-5天后收集细胞上清，浓缩处理后用 protein A亲和层析柱纯化。(2)血小板聚集实验将血小板冻干粉(Biopool)溶于TBS中，以每孔60ul分装至96孔板中。用PBS稀释VWF(CaIbiochem)至10ug/ml，以每孔IOul分装至96孔板中。将制备的人源化抗体 (重链可变区为 SEQ ID NO :7，轻链可变区为 VL1(08)、VL2、VL4或VL7，即SEQ ID NO 11-13 和SEQ ID NO :8)稀释至不同浓度，以每孔20ul加入96孔板中，放置5分钟。然后加入 IOul (15mg/ml)瑞斯托霉素(ristocetin)至每孔中，动态法测定在405nm时每孔的吸光值， 并根据吸光值的变化曲线计算抗体的活性。血小板溶于TBS中有一定的浑浊度，吸光值较 高，血小板聚集时，溶液变得澄清，吸光值变小，因此用比浊法可以初步测定抗体抗血小板 聚集活性的大小。参见图1。从VLl (08)和VL2的比较可以看出轻链的CDR3在抑制血小板 聚集中起到重要作用，含有全部轻链CDR的抗体VL7，其抑制能力最强，而含有CDR2和CDR3 的VL4，与仅含有⑶R3的VL2，具有相近的抗血小板聚集活性，进一步强调轻链⑶R3与vWF 结合的主导作用。(3)人血PRP (富含血小板血浆)的血小板聚集实验取正常人血30ml，柠檬酸钠抗凝管(BD，363095)分装，850rpm离心10分钟分离出 PRP,再3000rpm离心10分钟分离出PPP (不含血小板血浆)。用chrono_log 560双通道血 小板聚集仪测定，PPP调零，取460ul PRP至反应器皿中，加入20ul抗体(该抗体的重链可 变区为SEQ ID NO :7，轻链可变区为SEQ ID NO :8)，37°C温浴5分钟，加入磁力搅拌子，放入 血小板聚集仪中，调零后加入20ul ristocetin反应至结果稳定。参见图2。人源化抗体具 有与嵌合抗体相当的活性。(4)猴PRP (富含血小板血浆)的血小板聚集实验取正常猴血10ml，柠檬酸钠抗凝管(BD，363095)分装，1200rpm离心10分钟分离 出PRP，再3000rpm离心10分钟分离出PPP (不含血小板血浆)。用chrono-log 560双通 道血小板聚集仪测定，PPP调零，取460ul PRP至反应器皿中，加入20ul抗体(该抗体的重 链可变区为SEQ ID NO :7，轻链可变区为SEQ ID NO :8)37°C温浴5分钟，加入磁力搅拌子， 放入血小板聚集仪中，调零后加入20ul ristocetin反应至结果稳定。参见图3。人vWF和 恒河猴vWF高度同源，其Al区有97%的氨基酸相同，与鼠源抗体相结合的片段含有完全相 同的氨基酸。以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的 专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范 围中。
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权利要求
一种人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，其特征是，包括有鼠抗体NMC 4的重链可变区，该重链可变区含有的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列号1、2和3所示；重链可变区的框架区氨基酸序列与人抗体胚系基因位点VH4 59编码的框架区相同；鼠抗体NMC 4的轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3、或含有CDR2和CDR3、或含有CDR3，且CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列号4、5和6所示；轻链可变区的框架区氨基酸序列与人抗体胚系基因位点VL O8编码的框架区相同，或轻链可变区的框架区氨基酸序列与人抗体胚系基因位点VL O8编码的框架区相同，且其中第4节框架区的氨基酸由Phe Gly Gly Gly突变为Phe Gly Gln Gly。
2.根据权利要求1所述的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，其特征是，所述 重链可变区的氨基酸序列如序列号7所示。
3.根据权利要求2所述的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，其特征是，编码 所述重链可变区的氨基酸序列的DNA如序列号9所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，其特征 是，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列号8所示。
5.根据权利要求4所述的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体，其特征是，编码 所述轻链可变区的氨基酸序列的DNA如序列号10所示。
6.权利要求1-5所述的人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体在制备预防和治疗 人类血栓性疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述人类血栓性疾病为动脉血栓类疾病。
全文摘要
本发明公开一种人源化抗人血管性血友病因子单克隆抗体及其应用，所述抗体其包括有鼠抗体NMC-4的重链可变区，该重链可变区含有的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列号1、2和3所示；鼠抗体NMC-4的轻链可变区，该轻链可变区含有CDR1、CDR2和CDR3、或含有CDR2和CDR3、或含有CDR3，且CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列依次如序列号4、5和6所示。所述的单克隆抗体具有vWF结合能力，抑制血栓形成，免疫原性低等特点，可用于制备预防和治疗多种血栓类疾病的药物，为预防和治疗人类血栓性疾病特别是动脉血栓提供了一种可能。
文档编号A61P7/02GK101891820SQ20101020652
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者吴朝霞, 陈昌友 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院