一种制备IgY过程中的去脂液的配方及其配制方法
【技术领域】
[0001]本发明属于制备IgY的方法领域，具体地说，涉及一种制备IgY过程中的去脂液的配方及其配制方法。
【背景技术】
[0002]IgY(eggyolkantibody，IgY)抗体是通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50?10mg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。
[0003]与哺乳动物免疫球蛋白IgG(immun0gl0bulinG，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fe片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG <JgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG JiIgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点(PI)在5.7?7.6之间，在pH4.0?11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4°C储存6?7年活性下降仅5 % ; I gY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛I gG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强。
[0004]由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，IgY应用于检测也具有多方面的优势如:IgY与风湿因子、人类抗鼠抗体(HAMA)没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。
[0005]鉴于IgY的的应用不断推广，适用性不同的提取方法被不断地研发出来。传统的提取方法主要由酸化水提取法、PEG沉淀法、有机物抽提法、天然胶提取法、辛酸提取法、色谱法等方法。在工业生产IgY的过程中传统方法出现了提取试剂价格高、必须离心或低温反应步骤、耗时太久及涉及到危险试剂等影响成本控制或者应用范围的问题。同样，现有的单一型除脂配方难以在控制经济成本的前提下除去大多数的脂类从而得到纯度较高的抗体。
[0006]所以，对于技术人员来说，开发一种制备IgY过程中的去脂液的配方及其配制方法，设计合理，可针对免疫鸡蛋快速简单的提取抗体，并且可以去除卵黄中的大部分脂类及脂蛋白有，具体是，经鉴定，提纯的IgY抗体脂类残余小于8 %并且经SDS-PAGE鉴定纯度与常见的水提法等无差别，成为一个亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种制备IgY过程中的去脂液的配方及其配制方法，设计合理，可针对免疫鸡蛋快速简单的提取抗体，并且可以去除卵黄中的大部分脂类及脂蛋白有，具体是，经鉴定，提纯的IgY抗体脂类残余小于8%并且经SDS-PAGE鉴定纯度与常见的水提法等无差别。
[0008]为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:
[0009]—种制备IgY过程中的去脂液的配方，其特征在于:配方包括如下分量的及配比的原料:2-5 份的 PluronicF68，5-9 份的 PEG6000干粉，1-3 份的 CaCl2,0.3-1.5 份的 CH3COONa，余量为双蒸水。
[0010]作为一种优化的技术方案，配方包括如下分量的及配比的原料:3份的PluronicF68，7.5份的PEG6000干粉，1.5份的CaCl2，0.8份的CH3COONa，余量为双蒸水。
[0011]本发明还提供了一种制备IgY过程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于:
[0012]配置过程如下；
[0013](I)称取3g食用级PluronicF68加入200ml蓝盖丝口瓶；
[0014](2)称取 7.5gPEG6000 加入瓶中；
[0015](3)称取 1.5gCaCl2 加入瓶中；
[0016](4)称取0.85g的醋酸钠加入瓶中，并加入10ml的双蒸水，充分混匀形成澄清透明的卵黄去脂液，常温保存；
[0017](5)选取免疫蛋，分离蛋清与蛋黄，收集蛋黄液并以PBSl:4稀释为蛋黄稀释液；
[0018](6)将所述蛋黄液与之前配置的卵黄去脂液1:1进行混合，室温静置2h，使用纱布对分层卵黄液进行过滤，收取上清;所获得上清即为去除脂质后的IgY抗体液，保存在-20°c备用。
[0019]作为一种优化的技术方案，所述制备免疫蛋方法如下:向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300yg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为250yg/只。
[0020]作为一种优化的技术方案，所述PBS的pH值为7.4。
[0021 ]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明设计合理，可针对免疫鸡蛋快速简单的提取抗体，并且可以去除卵黄中的大部分脂类及脂蛋白有，具体是，经鉴定，提纯的IgY抗体脂类残余小于8%并且经SDS-PAGE鉴定纯度与常见的水提法等无差别。
[0022]同时下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0023]图1为本发明一种实施例中特异性IgY抗体效价测定的结果显示图。
【具体实施方式】
[0024]实施例:
[0025]一种制备I gY过程中的去脂液的配方，配方包括如下分量的及配比的原料:3份的PluronicF68，7.5份的PEG6000干粉，1.5份的CaCl2，0.8份的CH3COONa，余量为双蒸水。
[0026]本发明还提供了一种制备IgY过程中的去脂液的配方的配制方法，配置过程如下；
[0027](I)称取3g食用级PluronicF68加入200ml蓝盖丝口瓶。
[0028](2)称取 7.5gPEG6000 加入瓶中。
[0029](3)称取 1.5gCaCl2 加入瓶中。
[0030](4)称取0.85g的醋酸钠加入瓶中，并加入10ml的双蒸水，充分混匀形成澄清透明的卵黄去脂液，常温保存。
[0031](5)选取免疫蛋，分离蛋清与蛋黄，收集蛋黄液并以PBSl:4稀释为蛋黄稀释液。所述制备免疫蛋方法如下:向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300yg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为250yg/只。另外PBS的pH值为7.4。
[0032](6)将所述蛋黄液与之前配置的卵黄去脂液1:1进行混合，室温静置2h，使用纱布对分层卵黄液进行过滤，收取上清;所获得上清即为去除脂质后的IgY抗体液，保存在_20°C备用。
[0033]上述抽取的特异性IgY抗体效价进行测定:方法如下:
[0034](I)包被酶标版:用CBS溶液配制蛋白浓度为5yg/mL的抗原包被液，10yL/孔加入96孔酶标板，37°C温育过夜，弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次5分钟；
[0035](2)封闭:用5%脱脂奶粉，满孔封闭，37°C温育2h，弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次5分钟；
[0036](3)加IgY提取液:首先每孔加入10yL PBS铺底，取出分离纯化得到的IgY溶液，恢复至室温后，用稀释液I3BS 1:100稀释，取50yL加入第一孔，吹吸混匀后吸取50yL加入第二孔，依次倍比稀释至I: 102400 ο空白鸡蛋提取的IgY 50yL为阴性对照(NC)，PBS 50yL为空白对照(BC)，37°C温育Ih，弃去孔内液体，洗板；
[0037](4)加酶标二抗:辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY用I3BS 1:6000稀释，每孔加入10yL，37°C温育Ih，弃去孔内液体，洗板；
[0038](5)显色:加入新鲜配制的TMB-H202底物液10yL/孔，室温避光放置15?20分钟，弃去孔内液体，洗板；
[0039](6)终止:最后加入50yL 2mol/L的H2S04终止反应，在450nm波长处用酶标仪测其
OD值，每孔重复三次求平均值；
[0040](7)结果判定:求样品孔0D450值(P)与阴性对照孔0D450值(N)的比值，当P/N 2 2.1时，判断为阳性，所对应的抗体最大稀释倍数即为该抗体效价。
[0041 ] 如图1所示，结果显示特异性IgY在初免20天左右，开始产生抗体，在初免后90天左右，抗体滴度达到最高，即1:102400，停止加强免疫后，抗体效价仍能维持一个多月。效价与使用水提法等比较基本没有差别，在保存性上也有很好的表现。
[0042]本发明不局限于上述的优选实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或者相近似的技术方案，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种制备IgY过程中的去脂液的配方，其特征在于:配方包括如下分量的及配比的原料:2-5 份的 PluronicF68，5-9 份的 PEG6000 干粉，1-3 份的 CaCl2,0.3-1.5 份的 CH3COONa，余量为双蒸水。2.根据权利要求1所述的制备IgY过程中的去脂液的配方，其特征在于:配方包括如下分量的及配比的原料:3份的PluronicF68，7.5份的PEG6000干粉，I.5份的CaCl2，0.8份的CH3COONa,余量为双蒸水。3.根据权利要求1所述的制备IgY过程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于: 配置过程如下； (1)称取3g食用级PluronicF68加入200ml蓝盖丝口瓶； (2)称取7.5gPEG6000加入瓶中； (3)称取1.5gCaCl2加入瓶中; (4)称取0.85g的醋酸钠加入瓶中，并加入10ml的双蒸水，充分混匀形成澄清透明的卵黄去脂液，常温保存； (5)选取免疫蛋，分离蛋清与蛋黄，收集蛋黄液并以PBSl:4稀释为蛋黄稀释液； (6)将所述蛋黄液与之前配置的卵黄去脂液1:1进行混合，室温静置2h，使用纱布对分层卵黄液进行过滤，收取上清;所获得上清即为去除脂质后的IgY抗体液，保存在_20°C备用。4.根据权利要求3所述的制备IgY过程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于:所述制备免疫蛋方法如下:向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300yg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为250yg/只。5.根据权利要求3所述的制备IgY过程中的去脂液的配方的配制方法，其特征在于:所述PBS的pH值为7.4。
【专利摘要】本发明公开了一种制备IgY过程中的去脂液的配方，配方包括如下分量的及配比的原料：2-5份的PluronicF68，5-9份的PEG6000干粉，1-3份的CaCl2，0.3-1.5份的CH3COONa，余量为双蒸水。本发明设计合理，可针对免疫鸡蛋快速简单的提取抗体，并且可以去除卵黄中的大部分脂类及脂蛋白有，具体是，经鉴定，提纯的IgY抗体脂类残余小于8％并且经SDS-PAGE鉴定纯度与常见的水提法等无差别。
【IPC分类】C07K16/02, C07K1/14
【公开号】CN105541999
【申请号】CN201610065187
【发明人】张小莺, 任昊, 徐梦飞
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月29日