>[0168] 表4单克隆抗体3H11的预防、治疗结果
[0169]
[0170] "+"表示阳性，表示阴性。
[0171] 实施例5基因工程抗体的制备
[0172] 按照郝淑美等(郝淑美，李群，王承宇等.H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗 体基因的克隆及表达.病毒学报，2009,25(1) :63-67)在建立的单链抗体制备的操作方法， 用单克隆抗体3H11的重链可变区和轻链可变区序列（分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No.3) 制备相对应的单链抗体，依次为单链抗体1、2。
[0173] 将PCV2SH株病毒液(含200TCID5Q/0.1ml)分别与系列稀释的单链抗体1、2等体积混 合后，于37°C作用2小时，然后加入已长满单层的PK-15细胞，37°C孵育2小时后，弃上清，将 细胞用PBS洗涤后，于37°C、5%C02作用48小时，弃上清，同时设置接毒细胞对照和健康细胞 对照。将细胞用80%丙酮4°(3固定3〇1^11，用?!17.4?83洗涤3次，51^11/次，加入分别加入?(^2 单克隆抗体，37°C作用1小时，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，加入FITC标记的兔抗鼠 IgG置 于37°C作用1小时，用pH7.4PBS洗涤3次，5min/次，置于荧光显微镜下观察。以单链抗体1或2 阻止PCV2感染细胞的最高稀释度作为其中和抗体效价。
[0174] 按照实施例1.3.5操作方法，测定单链抗体中和效价。结果显示:单链抗体1、2均可 以抑制PCV2结合细胞，中和抗体效价均为1:32。表明：单克隆抗体3H11的可变区序列可用于 猪圆环病毒2型基因工程抗体的制备，并且所制备的基因工程抗体具有中和猪圆环病毒2型 的活性。
[0175] 以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽 然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人 员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修 饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实 质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种特异性结合猪圆环病毒2型单克隆抗体PCV2-MCAB2的可变区序列，其中，1)重链 可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添 加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体;2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No. 4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突 变获得的保守性变异体。2. -种由权利要求1所述可变区序列中重链可变区序列或其保守性变异体，和/或所述 的可变区序列中轻链可变区序列或其保守性变异体组成的抗体;所述抗体可以为单克隆抗 体、基因工程抗体;其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗 体、猪源单克隆抗体或所述抗体的片段;所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪 圆环病毒2型的能力；优选地，所述抗体为单克隆抗体PCV2-McAB2,所述单克隆抗体PCV2-McAB2重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.2,轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4。3. -种药物组合物，其中，所述药物组合物包括免疫量的具有所述单克隆抗体PCV2-McAB2可变区序列的所述抗体或所述抗体片段，以及药学上可接受的载体;优选地，所述药 物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2，以及药学上可接受的载体;优选地，所 述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区制备的单链抗体，以 及药学上可接受的载体;更优选地，所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2的重链可变区和轻链可变区序列制备的单链抗体，以及药学上可接受的载体。4. 一种抗体检测试剂盒，其中，所述抗体检测试剂盒包括有效量的权利要求2所述抗体 或所述抗体片段，猪圆环病毒2型抗原，以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检 测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中，所述抗体或所述抗体片段使用酶标记，所述用于 和猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的 底物;优选地，所述抗体检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2，猪圆环病毒 2型抗原，以及用于对猪圆环病毒2型的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性 对照。5. -种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单 克隆抗体PCV2-McABl和/或有效量的权利要求2所述抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪 圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中，所述用于对猪 圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述标记的酶产生颜色反应的底 物;优选地，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2-McABl和/或有效量的 权利要求2所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行 检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照，所述单克隆抗体PCV2-McABl选自下列抗猪圆环病毒 2型单克隆抗体2F8、3G12、C4D2、E3D4、3B2F4、9C3D2、B69、2E9，优选为抗猪圆环病毒2型单克 隆抗体2F8或3G12。6. -种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的抗猪圆环病毒2型单 克隆抗体PCV2-McABl和/或有效量的权利要求2所述抗体或所述抗体的片段，以及用于对猪 圆环病毒2型抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;其中，所述用于对猪 圆环病毒2型进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂为与所述抗体或所述抗体的片段结合 的酶标二抗以及与所述标记的酶产生颜色反应的底物，所述酶标二抗包括酶标羊抗鼠多 抗、酶标羊抗鼠二抗；优选地，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体PCV2- McABl和/或有效量的权利要求2所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进 行抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照，所述单克隆抗体PCV2-McABl选 自下列抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8、3G12、C4D2、E3D4、3B2F4、9C3D2、B69、2E9，优选为 抗猪圆环病毒2型单克隆抗体2F8或3G12。7. -种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体 PCV2-McABl、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗 体反应进行检测的检测试剂； 其中，所述抗原检测试剂盒包括缓冲液供应单元和酶免疫层析检测试纸条;所述缓冲 液供应单元用于将缓冲液供给所述酶免疫层析检测试纸条;所述酶免疫层析检测试纸条包 括硝酸纤维素膜(1 )，所述酶免疫层析检测试纸条在纵向上依次包括底物供应区、样品供应 区、检测区；所述底物供应区包括底物垫(3)，其上吸附有干燥的酶底物，所述底物垫(3)与 硝酸纤维素膜(1)接触，所述酶底物溶于缓冲液中并在硝酸纤维素膜(1)上向距所述缓冲液 供应单元的远端迀移;所述样品供应区包括酶标垫(2)，其上吸附有酶标记的所述单克隆抗 体PCV2-McAB2，所述酶底物能与所述单克隆抗体PCV2-McAB2上标记的酶产生显色反应，所 述酶标垫(2)与硝酸纤维素膜(1)接触，所述单克隆抗体PCV2-McAB2溶于缓冲液中并在硝酸 纤维素膜（1)上向距所述缓冲液供应单元的远端迀移；以及所述检测区固定化有所述单克 隆抗体PCV2-McABl; 其中，所述缓冲液供应单元包括展开液垫(5)、底物缓冲液槽(8)、底物缓冲液(9)和缓 冲液按钮，所述底物缓冲液(9)放置于底物缓冲液槽(8)中，所述缓冲液按钮位于底物缓冲 液槽(8)的上方，按下可将所述展开液垫(5)浸入缓冲液(9)中；所述检测区包括一条检测线 (6)、一条质控线(7)，其中，所述质控线（7)较检测线(6)更远离所述样品供应区，在所述检 测线(6)上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McABl，在所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠二抗 或羊抗鼠多抗，且吸附在酶标垫(2)上的酶标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2对于固定在 检测线(6)上的所述单克隆抗体PCV2-McABl而言是过量的;所述硝酸纤维素膜(1)全段粘附 在所述支撑物（10)上，支撑物（10)连接所述缓冲液供应单元，底物供应区，样品供应区，检 测区以及吸水垫（4)，所述吸水垫（4)在距所述缓冲液供应单元的最远端；以及检测样品 (11)加入的位置为所述酶标垫(2)的位置。8. -种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体 PCV2-McABl、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗 体反应进行检测的检测试剂； 其中，所述抗原检测试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板， 所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、 金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触 使得抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其上向底板第二端迀移;所述金标垫 上含有胶体金标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端 的位置包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体PCV2-McABl，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。9. 一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体 PCV2-McABl、有效量的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,以及用于对猪圆环病毒2型进行抗原抗 体反应进行检测的检测试剂;其中，所抗原检测述试剂盒包括荧光免疫检测试纸条，所述荧 光免疫检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端 的方向上依次由滤纸、样品垫、荧光垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与荧光 垫接触或与样品垫、荧光垫接触使得与抗原与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的结合体能在其 上向底板第二端迀移;所述荧光垫上含有荧光标记的所述单克隆抗体PCV2-McAB2,所述硝 酸纤维素膜上包括一条检测线和一条质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体 PCV2-McAB 1，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。10. -种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括包被所述单克隆抗体PCV2-McABl的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、对猪圆环病毒2型进行抗 原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照;优选地，所述抗原检测试剂盒包括 包被所述单克隆抗体PCV2-McABl的ELISA板、含酶标记所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应 液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳性对照；其中，所述洗涤液为磷酸盐 缓冲液，所述稀释液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色 液，所述终止液为2mol/l的浓H 2S04溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包 含灭活纯化后的猪圆环病毒2型的溶液。11. 一种抗原检测试剂盒，其中，所述抗原检测试剂盒包括包被猪圆环病毒2型抗原的 ELI SA板、含所述单克隆抗体的反应液、洗涤液、稀释液、底物显色液、终止液、阴性对照、阳 性对照;其中，或含所述单克隆抗体PCV2-McAB2的反应液、或含所述单克隆抗体PCV2-McABl 与所述单克隆抗体PCV2-McAB2的混合反应液;其中，所述洗涤液为磷酸盐缓冲液，所述稀释 液为含牛血清白蛋白的溶液，所述底物显色液为四甲基联苯胺TMB显色液，所述终止液为 2mol/l的浓H 2S04溶液，所述阴性对照为磷酸盐缓冲液，所述阳性对照为包含灭活纯化后的 猪圆环病毒2型的溶液。12. 如权利要求5-11任一项所述抗原检测试剂盒在非诊断目的的猪圆环病毒2型抗原 检测检测中的应用;优选地，所述非诊断目的的猪圆环病毒2型检测包括流行病学分析、对 离体组织进行检测以及定性和定量鉴别检验含猪圆环病毒2型和其他抗原的疫苗组合物中 的猪圆环病毒2型抗原的检测。
【专利摘要】本发明公开了一种单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体为抗猪圆环病毒2型单克隆抗体3H11，主要用于含该单克隆抗体3H11的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒、抗原检测试剂盒、药物组合物，属于生物医药领域。本发明提供抗体检测试剂盒可区分PCV1和PCV2的感染，以便对猪群的免疫状况进行实时监测，为防止PCV2感染起到重要作用；抗原检测试剂盒可实现检测样品中的PCV2抗原，减少了假阳性率，对控制PCV2的感染具有重要意义。本发明的单克隆抗体3H11对猪圆环病毒病具有预防和/或治疗作用，弥补现有疫苗单一的预防作用。CCTCC NO：C201419820141103
【IPC分类】G01N33/569, G01N33/577, A61P31/20, C07K16/08, A61K39/42, G01N33/558
【公开号】CN105542000
【申请号】CN201610003044
【发明人】田克恭, 韩水仲
【申请人】洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月5日