专利名称：一种适用于转人溶菌酶基因牛、猪的快速简便检测方法
技术领域：
本发明属于转基因成分的检测技术领域，具体涉及一种转人溶菌酶牛、猪的转基因成分的快速简便的检测方法。
背景技术：
转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。人溶菌酶是溶菌酶中的一类，主要存在于人体体液和组织中，人溶菌酶活性较猪、牛等家畜高3000倍以上。除了天然的抗菌活性，人溶菌酶与机体的防御体系也密切相关，研究表明其具有抗炎、抗肿瘤、提高机体免疫力等功能(Guo TK, Zhao X，X ie XD,et a. I The anti-proliferative effects of recombinant human lysozyme onhuman gastric cancer cells [J]. J In tMed Res, 2007, 35 (3) :353-360.)中国农业大学 的李宁教授已经成功培育出了一批转人溶菌酶转基因奶牛及转基因猪，数量达到了一定规模。这标志着我国转基因奶牛、转基因猪等转基因动物制备和动物生物反应器技术达到了国际先进水平。鉴于转人溶菌酶基因奶牛、猪生产技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测人溶菌酶的方法，具有必要性和紧迫性。目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行，核酸水平的检测应用更为广泛。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。可以根据检测目的不同，将检测转基因生物及其产品的PCR技术分为两类定性PCR和定量PCR。定性PCR主要是在PCR扩增之后，通过电泳初步鉴定结果为阳性或者阴性，PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。定性PCR在常规PCR基础上根据研究需要还发展了多重PCR、巢式PCR、热不对称交错PCR和电化学发光PCR等。定量PCR可以对检测样品中转入基因的表达量和拷贝数进行量化检测。在进行转基因生物及其产品检测中根据不同需要和检测目的来选择进行定性或定量检测。在进行外源基因核酸水平检测中通常需要进行PCR扩增和电泳检测两个环节，但是普通的PCR，以及灵敏度更高的巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖PCR仪等精密仪器，检测费用高，对检测人员有较高的技术要求，无法在条件较差的基层实验室进行。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种适用于转人溶菌酶牛、猪的快速简便检测方法，利用环介导等温扩增法原理建立外源基因的快速检测方法，能准确快速检测出转基因牛、猪中人溶菌酶基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供借鉴。
实现本发明的技术方案如下(I)引物设计及合成根据人溶菌酶的基因序列(Gene Bank accession NC_000012)设计特异性引物，所述引物对的DNA序列如下所示FIP :5’ -GATTCCCCTGTAGCCATCCATTCAGGTCTTTGAAAGGTGTGAG-3’ ；BIP :5’ -AGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGACTTCCTTCTCTCCTAGTGTC-3’ ；F3 :5’ -CCTTTCTGTTACGGTCCAG-3’ ；B3 :5，-CTCAAAGCCCCTTCTTCT-3，； (2)环介导等温扩增反应以引物FIP、BIP为内引物，引物F3、B3为外引物对人溶菌酶基因进行恒温扩增，其反应体系为1M甜菜碱，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ 2mM,8U Bst NDA聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0.2 μ Μ，内引物FIP和BIP各1.6 μ Μ，补双蒸水至25 μ 1，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于95°C反应5min，反应后立即冰浴l-2min，再加入8U Bst NDA聚合酶，于61°C反应60min，80°C下反应5min后终止反应；(3)环介导恒温扩增产物检测I)琼脂糖凝胶电泳取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(浓度为40 %的甘油，O. 2%溴酚蓝，59. 8% O. 25Μ Tris-Hcl)，混勻，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min,得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则判定为含有人溶菌酶基因(即含有转基因成分)，若没有阶梯型条带则判定为不含人溶菌酶基因。2)荧光染料染色将SYBR Green I荧光染料稀释100倍(按体积计)后作为工作液，取5μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人溶菌酶基因，若加入SYBR Green I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含人溶菌酶基因。本发明所设计的两对特异引物成功建立了对人溶菌酶快速、灵敏、特异而又简单实用的检测方法。与其它传统PCR方法相比该发明有以下优点I.本发明经济实用反应是在恒温的条件下进行，所以不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，例如水浴锅即可。2.本发明的灵敏度高采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人溶菌酶目的基因，比普通的PCR的灵敏度高100倍。3.本发明的特异性强本发明采用4条引物，可识别6个特异性区域，增加了与目的基因结合的特异性。4.本发明的检出率高对5头转人溶菌酶的转基因牛及2头转人溶菌酶的转基因猪进行检测，均检测出转基因成分，检出率为100%。5.本发明检测简单直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。
序列表SEQ ID NO :I是本发明扩增的人溶菌酶基因HLY的片段。图I :是本发明扩增的人溶菌酶基因的特异片段，片段全长为190bp，序列线条标记部分为引物所处位置，序列中方框所示位置为限制性内切酶HinfI所识别的酶切位点。
图2 :PCR扩增人溶菌酶基因电泳图，图中M DL2000 DNA marker ;1_5 :模板为人基因组DNA ；6 :模板为牛基因组DNA ；7 :模板为猪基因组DNA ；8 :水。图3 :LAMP扩增人溶菌酶基因电泳图，图中M DL2000 DNA marker ;1_5 :模板为人基因组DNA ；6 :模板为牛基因组DNA ；7 :模板为猪基因组DNA ；8 :水。图4 :LAMP扩增人溶菌酶基因可视化结果，图中1_5 :模板为人基因组DNA ；6 :模板为牛基因组DNA ；7 :模板为猪基因组DNA ；8 :水。图5 =LAMP产物酶切组成图，图中方框所示部分为酶切后产物组成。图6 =LAMP扩增产物酶切验证电泳图，图中M DL2000 DNA marker ；1 LAMP扩增产物；2 :酶切后的LAMP扩增产物；3 :水。图7 =LAMP扩增人溶菌酶检出限试验，图中M DL2000 DNA marker ;1_7 1 181'-1^质粒拷贝数依次106，105，104，103，102，10、5拷贝；8 :牛的基因组DNA;9 :猪的基因组DNA ；10 :水。图8 =LAMP扩增人溶菌酶检出限试验可视化结果，图中1_7 :pMD18T_LYZ质粒拷贝数依次106，105，104，103，102，10、5拷贝；8 :牛的基因组DNA ；9 :猪的基因组DNA ；10 :水。图9 PCR扩增人溶菌酶检出限试验，图中M DL2000 DNA marker ;1_7 1 181'-1^质粒拷贝数依次106，105，104，103，102，10、5拷贝；8 :牛的基因组DNA;9 :猪的基因组DNA ；10 :水。图10 =LAMP检测转人溶菌酶的转基因牛，图中M DL2000 DNA marker ;1_5 :转人溶菌酶基因的转基因牛；6 :阳性对照，PMD18T-LYZ质粒；7 :阴性对照，牛基因组DNA ；8 :水。图11 =LAMP检测转人溶菌酶的转基因牛可视化结果，图中1_5 :转人溶菌酶基因的转基因牛；6 :阳性对照，pMD18T-LYZ质粒；7 :阴性对照，牛基因组DNA ；8 :水。图12 =LAMP检测转人溶菌酶的转基因猪，图中M DL2000 DNA marker ；1~2 :转人溶菌酶基因的转基因猪；3 :阳性对照，PMD18T-LYZ质粒；4 :阴性对照，猪基因组DNA ;5 :水。图13 =LAMP检测转人溶菌酶的转基因牛可视化结果，图中1_2 :转人溶菌酶基因的转基因猪；3 :阳性对照，pMD18T-LYZ质粒；4 :阴性对照，猪基因组DNA ；5 :水。
具体实施例方式实施例I :对人溶菌酶基因目的片段进行扩增I、DNA的提取与纯化按照常规方法采集人血样和牛血样，采用报道的酚-氯仿抽提法(参照萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京2005版方法)分别抽提人和牛基因组DNA，得到人或牛的基因组DNA。2.常规PCR扩增用常规的PCR扩增方法(萨姆布鲁克，黄培堂译.分子克隆实验指南[M].科学出版社.北京2005)以两条外引物即编号为F3、B3的引物扩增人基因组DNA中溶菌酶基因目的片段(其核苷酸序列见SEQ ID NO :1和图I所示，序列全长为190bp)。同时以牛基因组DNA、猪基因组DNA作为阴性对照。I)反应体系上游引物 F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgcl2, 75 μ M dNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因组DNA I μ L，用双蒸水补齐至10 μ L。
2)反应程序95°C，5min ;34 个循环95°C lmin，60°C lmin，72°C 20s ；72°C,5min。3)结果判定取2· 5μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(配方浓度为40 %的(ν/ν)甘油，60% (ν/ν)0. 25Μ Tris-Hcl, O. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，然后在2%的琼脂糖凝胶中电泳30min后，通过凝胶成像系统成像，可见长度为190bp的扩增片段，结果如图2所示。3、LAMP 扩增以引物FIP、引物BIP的核苷酸序列为内引物，以引物F3、引物B3所示的引物为外引物对人基因组DNA进行恒温扩增，同时以牛基因组DNA作为阴性对照。
I)反应体系试剂组成如下:1M 甜菜碱，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer,Mg2+ 2mM,8U Bst DNA聚合酶，I μ I模板，加外引物F3、B3各0. 2 μ M，内引物FIP、BIP各
I.6 μ Μ,补双蒸水至总体积25 μ I。2)反应程序将上述反应体系中除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于95°C反应5min，立即冰浴l-2min，再加入8U Bst DNA聚合酶，于61°C下反应60min，然后置80°C下5min终止反应。3)结果分析与判定①琼脂糖凝胶电泳取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(配方40 % (ν/V)甘油，60% (V/V)0. 25M Tris-Hcl, O. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察是否有阶梯型条带出现，若有阶梯型条带则判定为含有人溶菌酶基因，若没有阶梯型条带则判定不含人溶菌酶基因。②荧光染料染色SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5 μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加ASYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定含有人溶菌酶基因，若加入SYBRGreen I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含人溶菌酶基因。③结果判定在上述分析方法①中，在凝胶成相系统的紫外灯下，模板为人基因组DNA，即含有人的溶菌酶基因时，可以观察到阶梯型条带，而模板为牛基因组DNA时，即不含人的溶菌酶基因，则观察不到阶梯型条带，其结果如图3所示。在上述分析方法②中，当模板为人的基因组DNA，即含有人的溶菌酶基因时，扩增产物变为黄绿色，当模板为牛基因组DNA时，扩增产物为棕黄色，其结果如图4所示。4) LAMP扩增产物特异性检验对LAMP扩增产物进行酶切验证。LAMP扩增产物在电泳检测不是呈现一条带，而是呈现出由多条带组成的阶梯型条带，这是因为这种方法在扩增过程中形成以目的片段，连接在一起的长短不一的开环产物所造成。本发明中溶菌酶基因目的片段(其核苷酸序列见图I所示)大小为190bp，在88bp处存在限制性内切酶HinfI所识别的酶切位点，由于LAMP产物是由互相连接的环状结构组成，在酶切位点处切开的产物分别由图5中所示方框部分组成，酶切后的两段长度应分别是86bp和126bp。因此可使用HinfI对LAMP扩增产物进行酶切，验证LAMP扩增得到的阶梯型条带是否由溶菌酶基因目的片段所组成，若阶梯型条带能被HinfI识别而酶切，则酶切后电泳检测阶梯型条带不存在，且能获得大小为86bp和126bp的两个片段，则判定为阶梯型条带是由溶菌酶基因目的片段所组成的，亦即LAMP扩增所得到的产物是溶菌酶基因目的片段。①酶切反应体系取3 μ ILAMP扩增产物，加入O. 8 μ I限制性内切酶HinfI (购自Fermentas 公司)和 1μ I buffer,双蒸水补至 10 μ I。②反应程序于37°C恒温培养箱中酶切6小时。③结果判定取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(配方浓度为40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25Μ Tris-Hcl, O. 2% (w/v)溴酚蓝)，混匀，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min，在凝胶系统下成像，观察到酶切以后的LAMP扩增产物不再有阶梯型条带，结果如图6所示。结果说明本发明中LAMP扩增所得到的产物是溶菌酶基因目的片段。实施例2 :人溶菌酶LAMP检测方法灵敏度试验
用含人溶菌酶基因的质粒pMD18T-LYZ作模板，验证检测人溶菌酶LAMP方法的检出限，并与PCR方法的检出限作对比。具体步骤如下I、质粒 pMD18T-LYZ 的构建I)人溶菌酶基因目的片段PCR产物的回收纯化用PCR方法以两条外引物即引物F3(其序列见SEQ ID NO :4)、引物B3 (其序列见SEQ ID NO 5)扩增人基因组DNA中溶菌酶基因目的片段(其核苷酸序列见序列表SEQ ID N0:1或图I所示，序列全长为190bp)。反应体系上游引物F3 0.2μΜ，下游引物Β3 O. 2μΜ, 1μ I PCR buffer, I. 5mM Mgcl2, 75 μ M dNTPs,0. 5U DNA 聚合酶，人基因组 DNA
Iμ L,用双蒸水补齐至10 μ L。反应程序95°C，5min ;34个循环95°C lmin, 60°C lmin,72°C 20s ;72°C,5min。取50 μ L PCR产物在2%琼脂糖凝胶中电泳30min，凝胶成相系统上成像。结果可以看到190bp大小的片段，结果如图2所示(其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO :1或图I所示)。将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自北京原平皓生物技术有限公司)回收DNA。2)目的片段PCR产物与pMD18-T载体连接将回收产物与pMD18_T载体(购自武汉大风生物科技有限公司)连接，连接体系为0· 5μ L PMD-18T载体，3· 5μ L solution I，3 μ L回收产物，将上述试剂混匀后4°C连接过夜。3)连接产物的转化、PMD18T-LYZ质粒的鉴定及提取取5yL连接产物加入100 μ L大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，冰浴30min，42 °C循环水中热击90s，快速冰浴l-2min使细胞冷却，加入500 μ L LB液体培养基，37 °C摇床上培育45min，在4000rpm离心5min，弃去500 μ L上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100 μ L涂布于含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB琼脂平皿上，37°C培养12h。用经高压灭菌(121°C，高压蒸汽灭菌30min)的10 μ L移液器头挑取菌落置于800 μ L氨苄青霉素(ΙΟΟμ g/ml)的LB液体培养基中，37 °C摇床震荡培养4h，然后通过菌液PCR挑选阳性菌液，然后送上海生工生物工程技术有限公司测序，测序结果经比对确认以后，用质粒小提试剂盒(购自TIANGEN公司，按照试剂盒的说明书介绍的方法操作)提取质粒PMD18T-LYZ，并测定质粒浓度。4)计算质粒拷贝数计算质粒拷贝数，其公式为(6. 23 X IO23拷贝/mol) X (浓度g/ml) + [碱基数X (660道尔顿/碱基)]=拷贝数/ml经计算质粒pMD18T-LYZ拷贝数为10. OX IO13拷贝数/ml质粒用双蒸水将质粒PMD18T-LYZ进行倍比稀释，使其终浓度为25X 107拷贝/ μ 1，25Χ106 拷贝 / μ 1，25Χ105 拷贝 / μ 1，25Χ104 拷贝 / μ 1，25Χ103 拷贝 / μ 1，25Χ102 拷贝/μ 1,25x1ο1 拷贝 /μ I。2、LAMP方法检测检出限试验利用本实施例中所计算出的已知含有人溶菌酶基因检测目的片段(190bp)拷贝数的质粒PMD18T-LYZ为模板，采用LAMP方法和PCR方法进行检测的灵敏度试验。I)LAMP方法扩增不同拷贝数的质粒pMD18T_LYZ
以引物FIP、BIP为内引物，以引物F3、B3(序列表SEQ ID NO :4和5)为外引物对本实施例中步骤I得到的质粒PMD18T-LYZ进行LAMP扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为IO6 个，IO5 个，IO4 个，IO3 个，IO2 个，10，5 个。①反应体系试剂如下在总体积为25 μ I的反应体系中IM甜菜碱,400 μ MdNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 2mM,8U Bst DNA 聚合酶，I μ I 模板，加外引物 F3、B3各0.2 μ Μ，内引物FIP、BIP各1.6 μ Μ，补双蒸水至总体积25 μ I。②反应程序将上述反应体系除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，95°C反应5min，立即冰浴l-2min，再加入8U Bst DNA聚合酶，于61°C下反应60min，然后置80°C下5min终止反应。2)PCR方法扩增不同拷贝数的质粒PMD18T-LYZ同时以两条外引物F3、B3(见序列表SEQ ID NO :4和5)进行PCR扩增，使体系中含质粒拷贝数依次为IO6个，IO5个，IO4个，IO3个，IO2个，10个，5个.①反应体系上游引物F3 O. 2μΜ，下游引物 B3 O. 2 μ Μ，I μ I PCR buffer, I. 5mMMgcl2, 75 μ M dNTPs，0. 5U DNA聚合酶，人基因组DNA I μ L，用双蒸水补齐至10 μ L。②反应程序95°C，5min;34 个循环95°C lmin, 60 °C lmin, 72 °C 20s ；72°C,5min。I)结果分析经琼脂糖凝胶电泳后得到结果当pMD18T-LYZ质粒为10个拷贝时，LAMP方法能扩增出阶梯型条带，而当PMD18T-LYZ质粒为5个拷贝时，LAMP方法未能扩增出阶梯型条带，因此判定LAMP对pMD18T-LYZ质粒的扩增下限为10个拷贝，结果如图7所示。LAMP扩增产物中，取5μ I加入O. 5μ ISYBR Green I工作液，在日光下用肉眼观察结果，结果质粒拷贝数依次为IO6个，IO5个，IO4个，IO3个，IO2个，10个时，扩增产物变为黄绿色，而质粒拷贝数为5时，扩增产物则为棕黄色。结果如图8所示。经琼脂糖凝胶电泳后得到结果当pMD18T-LYZ质粒为IO3个拷贝时，PCR方法能扩增出特异性条带，当PMD18T-LYZ质粒为IO2个拷贝时，PCR方法未能扩增出特异性条带，因此判定PCR方法对pMD18T-LYZ质粒的扩增下限为IO3个拷贝，结果如图9所示。本实施例中，LAMP方法灵敏度高，采用本方法可以检测下限至10个拷贝的人溶菌酶目的基因，是普通PCR灵敏度高100倍。实施例3 :对转人溶菌酶的转基因牛进行LAMP检测对5头转人溶菌酶的转基因牛及2头转人溶菌酶的转基因猪进行LAMP检测，试验中所用转基因牛的基因组DNA以及人的基因组DNA样品，均稀释到20ng/y I。I) LAMP 扩增过程以 FIP (序列表 SEQ ID NO :2)、引物 BIP (序列表 SEQ ID NO 3)为内引物，F3(序列表SEQ ID NO :4)、B3(序列表SEQ ID NO 5)为外引物对人溶菌酶DNA进行恒温扩增，反应体系为1M 甜菜碱，400μΜ dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+ 2mM,8UBst NDA聚合酶大片段，I μ I模板，外引物各O. 2 μ Μ，内引物各I. 6 μ Μ，补ddH20至25 μ 1，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，95°C反应5min，立即冰浴l_2min，再加入8U Bst NDA聚合酶大片段，59°C反应60min，80°C反应5min后终止反应；2)结果分析①琼脂糖凝胶电泳取2. 5 μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液(40% (ν/ν)甘油，60% (ν/ν) O. 25Μ Tris-Hcl7O. 2% (w/v)溴酹蓝)，混勻，再于2%琼脂糖凝胶中电泳30min,得到凝胶成像，观察是否有阶梯型条带，若有阶梯型条带则含有人溶菌酶基因，若没有阶梯型条带则不含人溶菌酶基因。
②荧光染料染色将SYBR Green I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5 μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。若加ASYBR Green I工作液后，扩增产物变为黄绿色，则判定为含有人溶菌酶基因，若加入SYBRGreen I工作液后，扩增产物为棕黄色则判定为不含人溶菌酶基因。③结果判定本实施例的LAMP检测方法以及作为对照的PCR方法均检测出了阳性转基因牛、猪的溶菌酶基因成分，结果分别如图10、图11、图12、图13所示。
权利要求
1. 一种转人溶菌酶基因牛、猪的快速、简便检测方法，其步骤包括 (1)引物设计及合成根据人溶菌酶的基因序列设计特异性引物，所述引物的DNA序列如下所示FIP :5’ -GATTCCCCTGTAGCCATCCATTCAGGTCTTTGAAAGGTGTGAG-3’ ；BIP :5’ -AGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGACTTCCTTCTCTCCTAGTGTC-3’ ；F3 :5’ -CCTTTCTGTTACGGTCCAG-3’ ；B3 :5’ -CTCAAAGCCCCTTCTTCT-3’ ； (2)环介导等温扩增反应 以引物FIP、BIP为内引物，引物F3、B3为外引物对人溶菌酶基因进行恒温扩增，其反应体系为IM 甜菜碱，400 μ M dNTPs,2. 5μ I IOXBst Buffer, Mg2+2mM,8U Bst NDA 聚合酶，1μ I模板，外引物F3和Β3各0·2μΜ，内引物FIP和BIP各1·6μΜ，补双蒸水至25μ 1，将上述除酶以外的所有试剂混匀置于200 μ I EP管中，于95°C反应5min，反应后立即冰浴l-2min，再加入8U Bst NDA聚合酶，于61°C反应60min，80°C下反应5min后终止反应； (3)环介导恒温扩增产物检测 1)琼脂糖凝胶电泳取2μ I扩增产物，加入I μ I上样缓冲液，该缓冲液包含浓度为40%的甘油、O. 2%溴酚蓝和59. 8% O. 25Μ Tris-Hcl，混匀，再按重量/体积计加2%琼脂糖凝胶，于5V/cm下电泳30min,得到凝胶成像,观察是否有梯形条带出现； 2)将SYBRGreen I荧光染料稀释100倍后作为工作液，取5 μ I的环介导等温扩增产物，再加O. 5 μ ISYBR Green I的工作液，在日光下用肉眼观察结果。
全文摘要
本发明属于转基因动物中转基因成分的分子检测技术领域，具体涉及提供一种适用于转人溶菌酶基因牛、猪的快速简便检测方法，本发明利用环介导等温扩增法原理，准确快速检测出转基因牛、猪中的人溶菌酶基因。本发明不需要特殊设备，为基层检测人员提供一种快速简便的方法，本发明的方法同时也为转基因生物及其产品安全评价和管理提供了实用的分子检测方法。
文档编号C12Q1/68GK102864210SQ20111019746
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者刘榜, 翟珊莉, 刘楚新, 张庆德 申请人:华中农业大学