猪背膘厚相关slc13a5基因的分子克隆及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于家畜分子分子生物学【技术领域】，具体涉及猪SLC13A5基因的分子克隆及应用。本发明所述的分子标记由SLC13A5基因克隆得到，其SLC13A5分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示。SLC13A5基因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的SLC13A5基因序列设计引物，以猪的基因组DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR－RFLP进行基因分型，发现第251bp处有一个T/C的碱基突变，导致PCR-RFLP-Bsu36I多态性，并利用该标记检测了中外猪种的情况。本发明为猪标记辅助选择提供了新的分子标记。
【专利说明】猪背膘厚相关SLC13A5基因的分子克隆及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜分子生物学【技术领域】，涉及一种包含如SEQIDN0 :1所示猪基因 核苷酸的核酸分子。本发明还涉及如SEQIDN0:1所示的SLC13A5基因的分子克隆方法及 多核苷酸序列中的单核苷酸多态性位点以及检测所述单核苷酸多态性位点的方法。
【背景技术】
[0002] 猪肉是动物性蛋白的主要来源，随着人们生活水平的提高，对肉质的要求也相应 提高。影响猪肉质的因素有遗传和非遗传的，猪肌内脂肪含量对肉质性状有很大的影响，一 般来说，肌内脂肪含量越高，猪肉质越嫩，从而肉质越好。肉质性状大多属于数量性状，由微 效多基因控制。许多肉质性状只能在动物屠宰后才能测定，所以常规选育只能进行同胞或 半同胞测定，这样必加大选育成本，且遗传进展缓慢。猪基因组草图的构建，使得寻找影响 肉质性状的主基因或与其紧连锁的分子标记成为可能，这些分子标记一经确认，就可进行 标记辅助选择育种。利用分子标记进行辅助选择（MAS)进行肉质性状改良是一种有效的途 径。
[0003] 动物、植物和酵母SLC13 家族（Solutecarrierfamilyl3member5，SLC13A5)包 括SLC13A1、SLC13A2、SLC13A3,SLC13A4 和SLC13A5 五个相关蛋白，SLC13 蛋白编码含有 8-13个跨膜结构区域的多跨膜蛋白，分布于众多的组织中，且以肾脏和胃肠道上皮细胞中 的表达量最多。在质膜的上皮细胞（肾、小肠、胎盘和肝脏）和中枢神经细胞中，哺乳动 物SLC13成员介导Na+耦合的阴离子协同运输，其中NASI(SLC13A1)和NAS2(SLC13A4)负 责协同转运蛋白运输硫酸、硒和硫代硫酸钠阴离子，而NaDCl(SLC13A2)、NACT(SLC13A5)和 NaDC(SLC13A3)运输双羧酸循环和三羧酸循环中间体，例如：琥珀酸、柠檬酸和a-酮戊二 酸。研究发现敲除SLC13A5基因的小鼠的干细胞ATP/ADP比下降，依次激活肝脏AMP激活蛋 白激酶（AMPK)信号通道、诱导过氧化酶体增殖物激活受体Y共激活因子_la(PGC-la)、 抑制乙酰辅酶A羧化酶-2 (ACC-2)以及减少固醇调节元件结合蛋白（SREBP-lc)的含量，从 而促进了肝脏线粒体的生物合成作用，最终使得脂质氧化、能量消耗且肝脏脂质的从头合 成得到抑制。此外，敲除SLC13A5基因还能有效抑制高脂饲料或年龄导致的小鼠肥胖和胰 岛素代谢紊乱且该基因表达量还受营养物质的调控。研究还表明，钠依赖柠檬酸转运蛋白 (NaCT)是导致神经元受损的主要原因，且SLC13A5基因CpG位点的DNA甲基化也是肾通透 细胞癌CpG岛甲基化表型的标志，神经胶母细胞SLC13A5的CpG位点在启动子甲基化和表 达水平之间呈负相关。ElangovanGopal等研究发现人类H印G2、Huh-7和大鼠MH1C1肝细 胞株对柠檬酸吸收均主要取决于Na+，相对柠檬酸循环中间体而言，这些细胞株对柠檬酸盐 更具亲和力，值得注意的是Li+对人SLC13A5转运蛋白起激活作用而对大鼠的该蛋白则起 抑制作用。
[0004] Hirwa等（2013)利用基因芯片技术，以8周龄的生长速度快的外来品种白洛克鸡 和生长速度慢的中国地方品种杏花鸡两个鸡种为实验材料，结果发现该基因在杏花鸡的下 丘脑中下调表达。
[0005] Luo等（2012)以大白猪和东北民猪构建F2代资源家系，F2代有455头猪，所用基 因芯片为P〇rcineSNP60K，测量了背最长肌的肌内脂肪含量、大理石纹、肉色等指标，全基因 组关联分析（GWAS)研究表明，SLC13A5基因与猪的肌内脂肪含量显著相关。
[0006] 目前国内外对猪SLC13A5基因在不同猪种和不同组织之间表达量差异性的研 究未见报道，与该基因相关报道甚少，本发明首次利用RACE(RapidAmplificationcDNA Ends)技术克隆猪SLC13A5基因cDNA全长，并筛选了该基因的SNP，并用PCR-RFLP技术进 行了分型，并分析了该基因与猪校正背膘厚及达l〇〇kg日龄的相关关系。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克隆猪SLC13A5基因cDNA分子，寻找SLC13A5基因的单核苷酸 位点以及基因多态性的检测方法，为猪肉质性状标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
[0008] 本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种克隆和检测猪 SLC13A5基因的分子标记及其应用，为猪肉质性状标记辅助选择提供有用的分子标记。 [0009] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：以人的SLC13A5基因序列 (GenBank收录号为NM_001284509. 1)为种子序列，在GenBank中利用BLASTN(BasicLocal AlignmentSearchToolNucleotide)，参照其同源性在 80% 以上的猪EST(Expression SequenceTags)设计特异引物，利用RACE(RapidAmplificationofcDNAEnd)，克隆出猪 SLC13A5基因cDNA全长，该猪SLC13A5基因的DNA序列如SEQIDNO:1所示。SLC13A5基 因的多态性是利用比较基因组学方法根据人的SLC13A5基因序列设计引物，以猪的基因组 DNA为模板扩增，扩增片段利用测序筛选SNP，并利用PCR-RFLP进行基因分型技术，发现第 251bp处有一个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Bsu36I多态性，并利用该标记检测了中外 猪种的情况。
[0010] 试验材料：25日龄沙子岭猪由湖南省湘潭市沙子岭猪资源场提供，取背最 长肌-80°C保存，5 '-RACEVersion2. 0 试剂盒购于Invitrogen公司，3 '-RACE SMARTer?RACEcDNAAmplificationKit试剂盒购于Clontech公司。
[0011] 总RNA提取与cDNA第1链的合成：用SUPERSCRIPTIIRT酶和特异性引物GSP-1 对总RNA进行基因第一链cDNA的合成，使用RNaseMix对合成的cDNA进行去RNA处理，最 后对cDNA进行纯化。
[0012] 引物设计：据GenBank人SLC13A5基因（登录号NM_001284509. 1)序列保守区设计 引物，引物设计的软件为PrimerPremier5. 0,引物设计的原则是特异性引物长度在23-28 个核苷酸，GC含量在50% -70%，退火温度在65-70°C，使用巢式PCR进行扩增。
[0013] 编码序列PCR扩增：以合成的猪cDNA为模板，在保守区设计引物经过克隆测序，获 得该基因部分⑶S(codingdomainsequence)序列。
[0014] 5' -RACE扩增：使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA末端加上多聚C，使用引物 GSP5(Gene-SpecificPrimers)和试剂盒中的桥连铆钉引物AUAP(表1)对已经加dC尾的 cDNA进行PCR第一轮扩增；使用引物GSP-3和试剂盒里中的桥连通用扩增引物AUAP进行 巢式PCR第二轮扩增，将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，纯化后 的PCR产物与pMD18-T进行连接，转化后对阳性克隆进行测序，获得557bp的目的序列。
[0015] 3' -RACE扩增：使用合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增。将第一轮PCR扩 增产物稀释50倍，然后用引物GSP3和UPM(UniversalPrimerAMix)(表1)进行第二轮PCR扩增。将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化。纯化后的PCR产 物与PMD18-T进行连接，转化后挑取阳性克隆测序。
[0016] 将扩增得到的5' -RACE长度为557bp、3' -RACE扩增得到的长度1320bp和开 放阅读框长度为1665的编码序列的序列拼接得SLC13A5基因的全长cDNA序列，并提交 GenBank，收录号为KF318030,并以此序列运用PrimerPremier5. 0设计引物，筛选该基因 第12外显子的SNP标记，并且PCR-RFLP进行标记的分型，从而完成本发明的有关内容。
[0017] 表1本发明中使用的引物序列
[0018]
【权利要求】
1. 一种猪SLC13A5基因如序列表SEQ ID NO :1所述；在序列表SEQ ID NO :1的251bp 处有1个A/G的碱基突变，导致PCR-RFLP-Bsu36I多态性。
2. 检测权利要求1所述的一种猪SLC13A5基因，扩增该片段的正向引物为 5，-CTCAITCCTGCGTCTTAITC-3，，反向引物为 5，-GCTGTGGGTGGTGTCAIT-3'。
3. 制备如权利要求1所述的猪SLC13A5基因的方法，按照以下步骤： 利用权利要求1所述的基因进行PCR扩增，PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，利用 限制性内切酶Bsu36I对PCR产物进行酶切鉴定，最后用2%琼脂糖凝胶电泳检测AA、AG和 GG基因型的分布。
4. 如权利要求1所述猪SLC13A5基因在猪分子标记辅助选择中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104342435SQ201410353019
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】马海明, 王玲玉, 柴玉兰, 肖定福, 杨虎 申请人:湖南农业大学