一种猪背膘厚性状的分子标记方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪背膘厚性状的分子标记方法。本发明方法包括猪基因组DNA的提取、长链脂酰辅酶A合成酶1（ACSL1）基因第17外显子引物设计、体外扩增和基因型检测。本发明首次发现长链脂酰辅酶A合成酶1（ACSL1）基因第17外显子的多态性与猪背膘厚存在着显著相关；并建立了检测第17外显子突变位点的限制性片段酶切多态性检测方法。本发明方法可以用于猪的育种中背膘厚性状的辅助选择，可实现种猪的早期选种，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，缩短了世代间隔，加快背膘厚性状的选择进程；该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较短（292bp），扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。
【专利说明】一种猪背膘厚性状的分子标记方法
【技术领域】
[0001]本发明属于动物的基因多态性【技术领域】，具体涉及猪长链脂酰辅酶A合成酶
I(ACSLl)基因多态性。
【背景技术】
[0002]外源及内源性的脂肪酸要进入其代谢途径必须进行活化，即催化合成脂酰辅酶A(Acyl-CoA),这是哺乳动物利用脂肪酸的第一步反应，ACS (Acyl-CoA Synthetase)在CoA和ATP存在的情况下催化游离脂肪酸合成Acyl-COA (Piccini等，1998)，催化反应是不可逆的，反应分为两步，第一步是催化游离脂肪酸与三磷酸腺苷(ATP)结合成脂酰一磷酸腺苷(Acyl-AMP)释放一个焦憐酸(Fatty acid+ATP — acyl-AMP+PPi);第二步是催化 Acyl-AMP与 CoA 结合成 Acy 1-CoA，并释放出一磷酸腺苷(AMP) (Acyl-AMP+CoA — acyl-CoA+AMP)。由脂肪细胞因子信号通路(Pathway:SSC04920)可知活化的脂肪酸，即脂酰辅酶A (Acyl-CoA)有三条去路:(1)经过磷酸甘油途径生成甘油二酯(DAG)，进而合成甘油三酯(TAG) ；(2)合成神经酰胺；(3)转运至线粒体中进行氧化，分解供能。因此脂酰辅酶A合成酶在脂肪酸合成与分解代谢中起着关键作用，属于多基因家族编码的酶，至少有25个成员组成(Jia等，2007)，根据催化脂肪酸的碳链长度的特异性可分为超长链脂酰CoA合成酶(VACSL，又称FATP)、长链脂酰辅酶A合成酶(ACSL)和中链脂酰辅酶A合成酶(MACSL) (Killenberg等，1971)。
[0003]ACSL基因家族成员在不同的组织中表达是不同的，暗示了每种ACSL成员可能在特定的组织中发挥着不同的特定作用(Li等，2010)。ACSLl在与能量代谢有关的组织，如肝脏、脂肪组织和肌肉组织中高表达，为合成甘油三酯提供脂酰CoA底物的最重要的长链脂酰CoA合成酶(Muoio等，2000)。Hendrik等(2007)研究大鼠心肌ACSL表达及酶活性时表明，ACSLl在胎儿期表达量`较低，出生后表达量逐渐增加，到成年时达最高值；ACSL3主要在胎儿时期表达，出生后表达量明显降低；ACSL4在出生前后差异较小，一直维持较高水平；ACSL5和ACSL6出生前后表达量均较低。大鼠的ACSL3和ACSL6在神经组织中高量表达(Oikawa等，1998 ;Basu_Modak等，1999)。而ACSL4在肾上腺中表达最高，但也在肝脏和类固醇生成组织中表达(Kang等，1997)。ACSL5在Rat的小肠上皮细胞中表达量最高，这有可能与合成的甘油三酯形成乳糜颗粒有关，对吸收食物性来源的脂肪酸有重要作用(Oikawa等，1998)。ACSL6在脑中表达量最高(Fujino等，1992)，编码的ACSL6蛋白偏向于催化超长链脂肪酸的活化(Marszalek等，2005)。Mercade等(2006)报道了猪的ACSL4基因多态性与生长速度和油酸含量存在着相关性。RuM等(2011)研究了杜长大商品猪ACSL4基因(mRNA Genbank登陆号DQ144454)3’ UTR区I个SNP位点(G2645A)多态性与21个肉质性状的相关性，结果表明只有6个性状与该位点多态性存在着相关，其中GG型个体肌内脂肪含量极显著高于AA型个体(P < 0.01)。
[0004]大鼠的ACSLl表达量受其他生理因素的影响，高碳水化合物的食物和高脂肪日粮将会提高ACSLl肝中表达量的7-8倍(Suzuki等，1990)，而脂多糖可降低ACSLl在肝、肌肉和脂肪组织中的表达量(Memo等，1998)。ACSLl在肝脏中超量表达能提高ACSLl酶活性的
3.7倍，并提高油酸在甘油二酯和磷脂中的量，但降低了油酸在胆固醇中的合成量(Li等，2006)。腺病毒介导的ACSLl在肝癌细胞0fepG2)超表达，导致酰基辅酶A合成酶活力提高了 20倍，增加了细胞中的ACSLl-CoA含量，提高了油酸在甘油三酯中的沉积(Parkes等，2006)，此研究中由于肉毒碱的量没有提高而导致CPT-1活性没有增加，从而不能将更多的ACSLl-CoA转运至线粒体中进行β -氧化，因此提高ACSLl的表达量可以增加细胞内脂肪的沉积量(Mashek 等,2007)。
[0005]目前有关家畜ACSL的研究多为基因多态性的检测。Li等(2012)对滇南小耳猪、藏猪和大约克的ACSLl基因多态性进行了检测，但未做关联分析，表明脂肪型猪与瘦肉型猪间的多态性存在着差异。Khandker (2009)研究了牛ACSL3基因的-757位由C突变为T的多态性检测，结果发现突变型T等位基因在杂交牛(456)、安格斯牛(206)和夏洛来牛
(187)中的基因频率分别为0.216,0.296和0.056，在杂交牛群中发现TT基因型个体比CC型个体的大理石纹高出9.63%，其它性状没发现有显著关联。Shogo等(2008)选择6个基因(包括ACSLl和ACSL4)作为日本黑牛肌内脂肪含量的候选基因研究了 ACSLl外显子2和ACSL4外显子2的多态性，只在ACSLl外显子上发现3个SNP，等位基因分布差异较大，所以没有进行ACSLl与表型性状的相关分析。Bionaz等人研究ACSL家族在奶牛泌乳前与泌乳期表达变化时发现，ACSLl基因在泌乳高峰期(泌乳60天)表达量最高，显著高于家族其它成员表达量，而且从产犊前15天至泌乳60天阶段ACSLl表达量持续上升，泌乳60天时比产前15天表达量提高了 5倍，但泌乳60天后至240天缓慢下降；ACSL3、ACSL4、ACSL5自产犊前15天至泌乳高峰期(60天)阶段的表达量有下降趋势，但泌乳60天后至240天有上升趋势；ACSL6在泌乳高峰期前表达量增加不明显，60天后迅速升高，泌乳240天比产前15天的表达量提高了 11倍，因此5种脂酰辅酶A合成酶(ACSLs)中ACSLl对乳脂率有重要影响。
[0006]目前，猪背膘厚(瘦肉率)性状的选择主要依靠超声波仪器(A超或B超背膘仪)测定种猪85kg至115kg体重时的活体`背膘厚，选择背膘薄的个体进行留种，该种选择方法，受外界因素影响较多，如饲料及环境的影响较大，致使测定的背膘厚度不一定能真实地反应猪的背膘，造成选种的准确性下降。由于猪的ACSLl基因与猪的产脂能力有关，本发明人发现该基因的第17外显子的第46位碱基由T突变为C，导致该位点对皮下脂肪(背膘)产生不同的效应，目前有关猪ACSLl基因多态性与背膘厚间的关联分析仍未见报道。
【发明内容】
[0007]为了实现猪长链脂酰辅酶A合成酶I(ACSLl)基因第17外显子突变体的检测，本发明提供一种猪背膘厚性状的分子标记方法。
[0008]本发明设计了猪ACSLl基因第17外显子引物，建立了第17外显子T46C位点突变体的检测方法，并分析了其多态性与背膘厚之间的相关性，确立了影响背膘厚的优良基因型，用于对猪背膘厚性状的选择，解决了传统的选种方法的盲目性大，选种准确性低的问题。
[0009]本发明猪背膘厚性状的分子标记方法的具体操作步骤如下:
[0010](I)猪基因组DNA的提取；[0011](2)长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子引物设计，所述引物为上游引物和下游引物，其序列如下:
[0012]上游引物:5’ -ACAGGCTCACTTCGCAGGTAGAT-3，，
[0013]下游引物:5’-GTTGGCTTGGAACCACTATTTGC-3’ ；
[0014](3)体外扩增
[0015]采用聚合酶链式反应，得到猪长链脂酰辅酶A合成酶I(ACSLl)基因第17外显子的体外扩增产物；
[0016](4)基因型检测
[0017]采用限制性内切酶酶切反应，得到酶切产物；对酶切产物进行多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测，选择其中条带为TT型个体留种。
[0018]猪的ACSLl基因第17外显子Tasl限制性内切酶酶切图2中第5、6、8泳道条带为TT型，第1、3、7泳道条带为CC型，第2、4泳道条带为TC型，M泳道为DL2000Marker。
[0019]所述体外扩增为聚合酶链式反应，具体操作步骤如下:
[0020]A、配制聚合酶链式反应体系
[0021]由4XdNTP2.Smmol / I 脱氧核苷三憐酸 2 μ 1-10mmol /ml 上游引物和 10mmol /ml 下游引物各0.5 μ 1、IOU/μ I Taq聚合酶0.4 μ 1、浓度50ng/μ I的猪DNA基因组溶液2 μ 1、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的IOX聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5 μ 1，加水17.1 μ I至终体积25 μ I ;并混合均匀，制得 25 μ I聚合酶链式反应体系；
[0022]B、聚合酶链式反应条件
[0023]将25 μ I聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下:
[0024]①95 °C预变性4分钟，
[0025]②95 °C 变性 30 秒，
[0026]③退火温度60°C 30秒，
[0027]④72 °C 延伸 30 秒，
[0028]⑤重复第②~④步骤35个循环，
[0029]⑥72°C延伸5分钟，最后降温至4°C保存，得到猪长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子的体外扩增产物；所述体外扩增产物的猪长链脂酰辅酶A合成酶
I(ACSLl)基因第17外显子第46位碱基由T突变为C。
[0030]所述基因型检测的具体操作如下:
[0031](I)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测
[0032]由于猪长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子第46位碱基由T突变为C，导致了一个Tasl限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是:取猪长链脂酰辅酶A合成酶I(ACSLl)基因第17外显子的体外扩增产物10 μ I于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入lOU/μ I的Tasl限制性内切酶1μ l，Tasl限制性内切酶缓冲液2μ 1，加水7 μ 1，混匀，温度37°C反应3小时，得到酶切产物；
[0033](2)多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测
[0034]将酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳I小时，电泳条件:常温，电压120V，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，猪的ACSLl基因第17外显子Tasl限制性内切酶酶切图中第5、6、8泳道条带为TT型，第1、3、7泳道条带为CC型，第2、4泳道条带为TC型，M泳道为DL2000Marker ；TT型个体为背膘厚性状优良基因型，选择其中条带为TT型个体留种，可降低猪的背膘厚，提高选留群体的瘦肉率。
[0035]本发明的有益技术效果体现在以下方面:
[0036]1.本发明通过对猪的ACSLl基因多态性与脂肪沉积的相关分析，首次发现ACSLl基因第17外显子第46位点多态性与猪背膘厚存在着显著相关。
[0037]2.可以用于猪的育种中背膘厚性状的辅助选择，可实现种猪的早期选种，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，运用该基因聚合方法可以经过一个世代就可以将ACSLl基因的优良基因型稳定下来，即经一个世代的选育即将该品系的背膘厚性状的优良基因达到纯合，而常规育种方法要经过大量的生产性能测定和后裔测定，并且要继代选育5个世代以上才能达到需要的效果，大大缩短了世代间隔，加快选择进程。
[0038]3.该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较短(292bp)，扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为本发明长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图。
[0040]图2为长链脂酰辅酶A合成酶I(ACSLl)基因第17外显子限制性内切酶(Tasl)酶切图。
【具体实施方式】
[0041]下面通过淮猪新品系和大约克猪群中的2个实施例，并结合附图对本发明作进一步地描述。`
[0042]以下实施例所用材料来源说明如下:
[0043]实施例中所用的材料为饲养在安徽省科鑫养猪育种有限公司的淮猪新品系猪287头，淮猪新品系是安徽省农科院畜牧兽医研究所培育的优质瘦肉型猪种，含有25%的淮猪血统，25%的长白血统和50%的大约克血统，有关淮猪新品系资料见:(I)《养猪》杂志2009年第4期，(2)《畜牧与饲料科学》杂志2009年30卷第6期，(3)《畜牧与饲料科学》杂志2009年第30卷第9期，(4)《安徽农业科学》杂志2007年35卷第25期等。另外I个材料是世界公认的瘦肉型的引进品种大约克猪，也采集于安徽省科鑫养猪育种有限公司，头数为239头。
[0044]一种猪背膘厚性状的分子标记方法的具体操作方法如下:
[0045](I)采集耳组织样
[0046]在仔猪出生当天，用猪耳号钳采取猪的耳缘组织0.2克左右，放入1.5ml的离心管中，倒入75%的酒精Iml左右，然后放入_20°C冰箱保存待用；
[0047](2)基因组DNA提取
[0048]从冰箱中取出耳缘组织，用剪刀将其剪碎，倒入DNA组织提取液600ul，其DNA组织提取液配方见表1，提取液现用现配。然后放入55°C水浴锅中温浴12小时，然后加入Tris饱和酚600 μ 1，上下摇动混匀15分钟，用低温高速离心机离心10分钟，离心机转速要求12000转/分钟；用Iml移液器取出上清液至已灭菌的1.5ml离心管中，再加入等体积的Tris饱和酚，再上下摇动混匀15分钟，再离心10分钟(12000转/分钟)；取上清液，加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(25: 24: I)混匀10分钟，离心10分钟(12000转/分钟)。取上清液加入等体积的氯仿:异戊醇(24: I)，混匀10分钟，离心10分钟(12000转/分钟)。取上清液加入2倍体积的冰乙醇(约Iml)，再加1/10体积的约60ml的NaAc (醋酸钠)水平摇动，可见絮状、白色DNA样品出现。将样品置于_20°C冷冻30分钟，取出或挑出DNA或离心(12000转/分钟)10分钟，DNA沉于管底。用75%乙醇洗涤DNA，摇动洗涤后，离心5-10分钟(12000转/分钟)。弃去75%的乙醇，自然干燥后，加入适量(约50ml)DNA稀释液(TE)溶解，放入_20°C冰箱中保存。
[0049]表1DNA组织提取液配方(总体积200ml)
【权利要求】
1.一种猪背膘厚性状的分子标记方法，其特征在于包括以下操作步骤: (1)猪基因组DNA的提取； (2)长链脂酰辅酶A合成酶I(ACSLl)基因第17外显子引物设计，所述引物为上游引物和下游引物，其序列如下: 上游引物:5 ’ -ACAGGCTCACTTCGCAGGTAGAT-3，， 下游引物:5’ -GTTGGCTTGGAACCACTATTTGC-3’ ； (3)体外扩增 采用聚合酶链式反应，得到猪长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子的体外扩增产物； (4)基因型检测 采用限制性内切酶酶切反应，得到酶切产物；对酶切产物进行多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测，选择其中条带为TT型个体留种； 猪的ACSLl基因第17外显子Tasl限制性内切酶酶切图2中第5、6、8泳道条带为TT型，第1、3、7泳道条带为CC型，第2、4泳道条带为TC型，M泳道为DL 2000 Marker。
2.根据权利要求1所述的一种猪背膘厚性状的分子标记方法，其特征在于:所述体外扩增为聚合酶链式反应，具体操作步骤如下: A、配制聚合酶链式反应体系
由4XdNTP2.5 mmol / I脱氧核苷三憐酸2 μ 1、10 mmol/ml上游引物和10 mmol /ml下游引物各0.5 μ 1、IOU/μ I Taq聚合酶0.4 μ 1、浓度50ng/μ I的猪DNA基因组溶液2 μ 1、含20 mmol/1氯化镁(MgCl2)的IOX聚合酶链式反应(PCR)缓冲液2.5 μ 1，加水17.1 μ I至终体积25 μ I ;并混合均匀，制得25 μ I聚合酶链式反应体系； B、聚合酶链式反应条件 将25 μ I聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条件如下: ①95 °C预变性4分钟，
(2)95 °C 变性 30 秒， ③退火温度60°C30秒， ④72°C延伸30秒， ⑤重复第②~④步骤35个循环， ⑥72°C延伸5分钟，最后降温至4°C保存，得到猪长链脂酰辅酶A合成酶I(ACSLl)基因第17外显子的体外扩增产物；所述体外扩增产物的猪长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子第46位碱基由T突变为C。
3.根据权利要求1所述的一种猪背膘厚性状的分子标记方法，其特征在于:所述基因型检测的具体操作如下: (O限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测 由于猪长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子第46位碱基由T突变为C，导致了一个Tasl限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶切反应操作步骤是:取猪长链脂酰辅酶A合成酶I (ACSLl)基因第17外显子的体外扩增产物10 μ I于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入IOU/μ I的Tasl限制性内切酶I μ 1，Tasl限制性内切酶缓冲液2 μ 1，加水7 μ 1，混匀，温度37°C反应3小时，得到酶切产物；(2)多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测 将酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳I小时，电泳条件:常温，电压120V，得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因型，猪的ACSLl基因第17外显子Tasl限制性内切酶酶切图中第5、6、8泳道条带为TT型，第1、3、7泳道条带为CC型，第2、4泳道条带为TC型，M泳道为DL 2000 Marker ；TT型个体为背膘厚性状优良基因型，选择其中条带为TT型个体留种，`可降低猪的背膘厚，提高选留群体的瘦肉率。
【文档编号】C12Q1/68GK103497994SQ201310404951
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】李庆岗, 陶立, 刘林清 申请人:安徽省农业科学院畜牧兽医研究所