一株重组表达γ-内酰胺酶的枯草芽孢杆菌、固定化及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程和生物工程领域，具体设及一株异源表达（+)-丫-内酷胺酶 的重组枯草芽抱杆菌，其重组细胞的制备和固定化方法，W及应用该催化剂对映选择性水 解外消旋丫-内酷胺生产光学纯（-)-丫-内酷胺的应用。
【背景技术】
[0002] (-)-2-氮杂双环-巧，2, 1]-庚-5-締-3-酬（简称文斯内醋，（-)-丫-内酷 胺），是一种碳环核巧类化合物合成的重要手性前体。丫-内酷胺的环戊締结构，可W使得 丫-内酷胺可W参与很多化学反应，比如环氧化，氮丙烷化，氣化，径基化，砸化，环丙化反应 等，因而可W合成多种手性药物，例如抗艾滋病药物阿己卡伟（Abacavir)、抗甲型流感及禽 流感药物帕拉米韦（Peramivir)和新型降糖药物美格列汀（Melogliptin)等。目前，众多 制备光学纯丫-内酷胺的方法中（物理法、化学法和生物法），生物法因为具有反应效率高、 立体选择性高、反应条件溫和、可重复使用、低能耗、污染少等优点，具有更广泛的应用。微 生物酶法拆分外消旋体丫-内酷胺具有良好的应用前景。
[0003] T-内酷胺酶是指能够水解拆分消旋体T-内酷胺的一类酶。挖掘具有高度立体 选择性和催化活力的丫-内酷胺酶，是生物法生产光学纯丫-内酷胺的关键。有报道利用 Pseudomonassp.、Miodococcusequi和Aurobacteriumsp.等全细胞不对称水解 丫-内 酷胺合成光学纯T-内酷胺，然而全细胞催化剂的立体选择性并不高。自基因测序技术的 革新，海量基因组数据的公开，W及基因工程方法的成熟等，利用基因工程菌异源表达目的 丫-内酷胺酶，可W避免野生菌遗传背景复杂和调控困难的难题，从而获得高效的催化剂。 此后对丫-内酷胺酶的研究多为采用大肠杆菌Escherichiacoli异源表达丫-内酷胺酶。 来源于硫横矿硫化叶菌（Sul化lobussolfatari州S)的（+)-丫-内酷胺酶研究和应用较 为深入，其具有>99%的对映选择性，但其最适反应溫度过高（80°C)，利用此酶进行生产过 程的能耗很大。通过蛋白比对的方法发现大豆慢生根瘤菌度radyrhizobiumjaponicum USDA6)也含有丫-内酷胺酶，然而其产物的光学纯度不高，ee值为96%。王建军等利用 基因挖掘的方法，发现了来自大肠杆菌巧.coli)异分支酸酶家族的Ru巧蛋白，同样具有 (+)-丫-内酷胺酶活性，然而其可溶表达较差。目前报道的（+)-丫-内酷胺酶对外消旋 丫-内酷胺拆分过程中存在的缺点主要有：（1) (+)-丫-内酷胺酶对外消旋丫-内酷胺拆分 的选择性较差；（2) (+)-T-内酷胺酶的稳定性差；(3)可溶性异源表达差，从而限制了其工 业化应用。
[0004] 本实验室前期筛选了具有（+)-丫-内酷胺酶活性的DelftiaSP.CGMCC5755菌株 (该菌株于2012年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，地址 为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），将该菌株来源的潜在（+) - 丫-内酷胺酶在大肠杆菌 中异源表达，发现大部分W无活性的包涵体形式存在，可溶性表达较低。本发明通过构建 重组质粒pM5-delm，实现了DelftiaSP.CGMCC5755来源的（+)-丫-内酷胺酶基因在枯草 芽抱杆菌168中的可溶性表达，对重组转化体进行包埋固定化W提高操作稳定性，进一步 利用该重组枯草芽抱杆菌不对称拆分丫-内酷胺，为制备光学纯（-)-丫-内酷胺提供了研 究基础。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种可溶性异源表达DelftiaSP.CGMCC5755 来源的（+)-丫-内酷胺酶的方法，并进一步提高重组细胞的操作稳定性，用于拆分外消旋 T-内酷胺，制备获得光学纯的（-)-T-内酷胺。
[0006] 本发明通过下述技术方案W解决上述技术问题：
[0007] 本发明所述（+)-丫-内酷胺酶的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNo.2所示；所 述的Delftiasp.保藏于中国普通微生物菌种保藏中屯、，保藏号为CGMCC5755,该菌株从 上壤中筛选获得，在发明专利（CN102719378A)中有详细说明。
[000引本发明还设及一种（+)-丫-内酷胺酶基因，其碱基序列如序列表SEQIDNo. 1所 示，或其编码由序列SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
[0009] 本发明的（+)-丫-内酷胺酶基因可来源于Delftiasp.CGMCC5755,具体制备方 法可为：根据GenBank中收录的DelftiaSP.来源的酷胺酶的基因序列设计合成引物，然后 WDelftiaSP.CGMCC5755的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得 完整的（+)-丫-内酷胺酶基因，碱基序列如SEQIDNo.1所示，命名为delm，全长1230bp， 该序列内无内含子，其编码蛋白质的氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。
[0010] 本发明设及包含（+)-丫-内酷胺酶基因的核巧酸序列的重组表达载体。其可通 过本领域常规方法将本发明的（+)-丫-内酷胺酶基因的核巧酸序列连接于各种载体上构 建而成。所述的载体可为本领域常规的克隆载体，如市售的质粒或病毒载体等，优选pM5。 较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的（+)-丫-内 酷胺酶基因产物和pMA5用限制性内切酶Ndel和BamHI双酶切，形成互补的粘性末端，再经 T4DNA连接酶连接，形成含有本发明（+) - 丫-内酷胺酶基因的重组表达质粒pMA5-delm。
[0011] 本发明进一步设及包含本发明的（+)-丫-内酷胺酶基因或其重组表达载体的重 组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中即可制得。本发明 优选枯草芽抱杆菌，更优选枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)168，W提高（+)-丫-内酷 胺酶的可溶性表达。将前述重组表达质粒pM5-delm转化至枯草芽抱杆菌168中，即可得 本发明优选的基因工程菌株，即枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)168/pMA5-delm。
[0012] 本发明还设及一种重组（+)-丫-内酷胺酶的制备方法，其包括W下步骤：培养本 发明的重组表达转化体，获得重组（+)-丫-内酷胺酶。其中所述的培养重组表达转化体所 用的培养基可为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的（+)-丫-内酷胺酶的培养基， 对于菌株，优选如下培养基：膜蛋白腺20g/l，酵母提取物16g/l，葡萄糖4g/l，^C1 5g/l， 化2册〇44g/L，KH2PO40. 5g/L，（NH4)2S04 3g/L。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可 W根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化 体能够生长并产生（+)-丫-内酷胺酶即可。优选下述方法：挑取单菌落至培养基中于37°C 过夜培养，按2~5%的接种量，接种到发酵罐，37°C培养，控制溶氧不低于15%，控制pH为 7. 0左右，发酵12h，收集细胞，并进行真空冷冻干燥，即可高效表达本发明的（+) - 丫 -内酷 胺酶。
[0013] 本发明还设及重组表达转化体的固定化方法，其包括如下步骤：将上述表达 (+)-丫-内酷胺酶重组枯草芽抱杆菌整细胞与固定化载体混合，获得固定化重组表达转化 体。具体如下：将Ig冻干细胞充分溶解于lOmL去离子水中，与3%的海藻酸钢溶液40mL混 合揽拌，通过注射器枕头将上述混合液W5cm高度注入1 %的氯化巧溶液中立即形成光滑 的微球体，并将此固定化小球保持在4°C的上述氯化巧溶液中硬化30min，进而在0. 3 %的 戊二醒溶液中进一步硬化，用生理盐水洗涂后将固定化细胞储存在4°C冰箱中备用。
[0014] 本发明进一步设及利用（+)- 丫-内酷胺酶作为催化剂在对映选择性拆分丫 -内酷 胺W制备光学活性丫-内酷胺中的应用。较佳的，所述的应用按下述方法进行：利用重组枯 草芽抱杆菌冻干细胞10~15g/L或固定化重组枯草芽抱杆菌整细胞10~15g/l，催化水 解lOOg/L丫-内酷胺底物，反应条件为反应溫度30°C，pH8~10,优选抑9. 0,揽拌转速 200~40化pm，优选40化pm。反应结束后，经过二氯甲烧萃取、减压蒸馈和干燥处理，最终获 得纯度大于99 %的（-)-丫-内酷胺。
[0015] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0016] 本发明的积极进步效果在于：成功实现了Delftiasp.CGMCC5755来源的 (+) - 丫-内酷胺酶基因在枯草芽抱杆菌中异源表达，对重组转化体全细胞进行了固定化进 一步提高了操作稳定性，并利用该重组转化体全细胞催化高效生产光学纯（-)-丫-内酷 胺。此为利用重组枯草芽抱杆菌生产光学纯（-)-丫-内酷胺的首例报道。在此发明中，发 酵法制备重组枯草芽抱杆菌为全细胞催化反应提供了稳定的催化剂；重组枯草芽抱杆菌体 现了较高的转化效率和立体选择性，优化的重组枯草芽抱杆菌转化体系具有很好的工业应 用开发前景。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0018] 下列实施例中的材料来源为：
[0019] 表达质粒pM5为实验室构建。
[0020] EscherichiacoliJM109,Bacillussubtilisl68 感受态细胞，高保真PCR酶和 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
[0021] 引物：
[0022] 化rward:5, -CGCCATATGGCCGAAACCCTGATCAAGGTCG-3
[0023]Reverse:5, -CGCGGATCCTTACTTGTCCTGGGCGATG-3'
[0024] 其中，上游引物下划线部分为Ndel酶切位点，下游引物下划线部分为BamHI酶切 位点。
[00幼培养基为（g/L):膜蛋白腺20,酵母提取物16,葡萄糖4,化C1 5，胞2册04 4，皿2口04 0. 5,（NH4)2S043。3L发酵罐，1.化发酵液，115°C灭菌，20m