新型人肿瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为201010268409. 3,申请日为2010. 09. 01，发明名称为新型人肿 瘤坏死因子受体-Fc融合基因及其产物蛋白的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明属于基因工程制药领域，具体设及一种新型TNFR-Fc融合基因及其表达产 物。
【背景技术】 阳003] 类风湿性关节炎烟leumatoid Art虹itis，RA)是人类最常见的自身免疫性疾病之 一，患病率约1%，与人类白细胞抗原DR4/DR1明显相关，具有一定的遗传倾向。RA的临床 特征多为手、足、腕、膝、臀等的关节滑膜发炎，最终导致关节损伤。滑膜炎引起大量淋己细 胞浸润，主要包括巨隧细胞、T淋己细胞和浆细胞，同时血管增生。关节损伤主要发生于滑 膜与软骨和骨邮邻处。
[0004] RA是一种W累及关节为主的系统性自身免疫性疾病。近年来研究表明，肿瘤 坏死因子-a灯NF-a)是RA发病机制中的关键因子（FeldmannM2001;RavinderN Maini，2001;RavinderNMaini，199),其可刺激机体产生一系列因子，如白细胞介素 (IU-1、比-6、IL-8和粒细胞集落刺激因子等的产生，并诱导内皮细胞表达黏附分子，吸引 白细胞到受累关节。TNF-a还刺激滑膜巨隧细胞、纤维母细胞、破骨细胞和软骨细胞产生 基质金属蛋白酶，并抑制软骨蛋白聚糖的合成，并可导致滑膜炎症和关节软骨的损伤。阻断 TNF-a即可在RA发病机制的上游阻断炎症反应，达到治疗RA的目的。
[0005] 肿瘤坏死因子a(Tumor化crosisI^actorA1地日，TNFa)和淋己毒素 化ymphotoxin，LT)是通过与其共同受体TNFR75和TNFR55结合而发挥生物学作用的。人肿 瘤坏死因子受体75灯NFR75)由461个氨基酸组成，其N-末端235个氨基酸残基，是TNFR75 蛋白酶水解下来的细胞膜外区片段，也称为可溶性TNFR75 (STNFR75)。
[0006] 大量实验证据表明可溶性TNFR75和TNFR55 (即受体的膜外部分）可W通过 与TNFa和LT的有效结合而阻断TNFa和LT在生物体内的生物学作用化unns-Martin Lorenz, 2002 ;smith，C.A.等（1990)，science, 248 :1019-1023)，且TNFR75 分布更广发，亲 和能力更强。但TNFR半衰期较短。
[0007] 人IgG类免疫球蛋白半衰期可高达21天，它们是人类血液中最丰富的蛋白质，分 为IgA、IgG、IgM、I姐和I曲，其中IgG有IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4 四个亚型。IgGlFc段由 232个氨基酸残基组成，包括较链区、C肥区和C册区。已有报道说将IgG的Fc绞链区中的 半脫氨酸残基与其他蛋白质（如各种细胞因子和可溶性受体）结合而形成融合蛋白，使蛋 白质类似于IgG分子但无CH1区域和轻链。由于结构上的同源，Fc融合蛋白表现出与类似 同种型的人IgG相当的体内药物动力学特性。
[0008] 国外已有人借助基因工程手段构建了人TNFRII型受体部分与IgG的Fc片段的融 合蛋白，此蛋白在离体条件下对TNF有中和作用（美国专利5, 605, 590)。国内也有构建此 类融合蛋白，马菁等在CN1417334A肿瘤坏死因子受体可溶部分的重组基因，及融合蛋白基 因与产物中构建了一种含有linker的融合蛋白；刘昌间等在CN1502632A新型TNFR-Fc融 合蛋白中构建了一种截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用双顺反子构建了一种 人肿瘤坏死因子可溶性受体II-抗体FC段融合蛋白。
[0009] 运类药物人源化程度高，引起的免疫原性反应低，治疗效果很好，比单靠止痛药和 抗炎药更有效控制病情。但目前运类治疗药物普遍存在制备方法复杂，表达量低，价格昂贵 等丞待解决的问题。
【发明内容】
[0010] 本发明解决的一个问题是提供了一种新型的重组人TNFR75-FC融合基因，及其表 达的蛋白质产物。
[0011] 本发明解决的第二个问题是构建了一种含有重组人TNFR75-FC融合基因片段的 重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc，转染哺乳动物细胞后，其真核细胞的扩增标记，可大幅提高目 的基因在宿主细胞中的拷贝数，从而提高目的蛋白的表达量。
[0012] 本发明解决的第S个问题是，提供了一种含有重组载体pCI-gs-TNFR75-Fc的哺 乳动物细胞，可W稳定表达TNFR75-FC。所述哺乳动物细胞可W是C册细胞、NS0细胞等常 用哺乳动物细胞工程细胞株。
[0013] 本发明解决的第四个问题是通过硫氨甲硫氨酸（MS讶加压扩增筛选，使表达目的 蛋白细胞株表达量提高至少一个数量级，在进行高效表达细胞株筛选时，最终将MSX浓度 提高到400~500 ym，筛选单克隆表达量达到20~30pg/cell?24虹。
[0014] 为解决上述问题，本发明通过如下技术方案来实施：
[0015] 抽提化-60细胞株的总RNA，RT-PCR扩增人STNFR75基因片段；PCR扩增人IgGlFc 基因片段。采用OverlapextentionPCR技术将两基因片段进行拼接得到编码riiTNFR:化 融合蛋白的全长cDNA序列。将获得的该cDNA序列插入克隆中间载体Teasy,经序列测定 证实正确后进行真核表达载体的构建。
[0016] rhTNFR:Fc融合蛋白cDNA片段克隆于表达载体，采用脂质体转染技术，将无菌抽 提的重组质粒riiTNFR:Fc/pCI-gs导入CH0细胞中，经MSX加压筛选，得到了高表达量的 rhTNFR:Fc融合蛋白的基因工程单克隆细胞株，在将MSX浓度提高到400~500ym时，筛选 单克隆表达量达到20~30pg/cell? 24虹。
[0017] 本发明通过OVERLAPPCR的方法合成了 一种人肿瘤坏死因子受体融合基因 TNFR75-FC，采用含有GS系统的真核细胞高效表达载体，在哺乳动物细胞中经过MSX加压筛 选使得该融合蛋白的表达量提高了 20个百分点，融合蛋白活性提高了 8个百分点。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于下述实施 例。
[0019] 实施例1人可溶性TNFR75CDNA的制备
[0020]1、PCR扩增TNFR75CDNA
[0021] 设计引物A:5，TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3，引物B:5，GTCACA AGATTTGGGCTCGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGC3'， 阳0巧设计另外一组引物，在引物B中将引入linker序列，该序列（Gly4Ser)3,为一编 码15个氨基酸的疏水性多肤，它们的活动度较好，不影响TNFR和Fc的天然立维结构，其 linker的DNA序列为 5'_GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGC AGC- 3'。
[0023] 设计引入linker序列的引物B。引物Linker-B:5'GCTGCCGCCACCGCCGCT TCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGTC。
[0024]W人早幼粒白血病细胞总RNA为模板，分别W引物A和B为模板、WA和Linker-B 为模板，进行RT-PCR反应，94°C变性 5min开始循环，94°C30sec，58°C30sec，72°CImin，共 32个循环，最后72°C延伸8min。得到编码STNFR75和对照sTNFR75-linker的基因片段。 阳02引 2、PCR产物的鉴定和凝胶回收
[0026] 将上述条件进行PCR，在琼脂糖凝胶电泳上进行鉴定，发现产物中目的蛋白分子量 大约8(K)bp的带，将该片段回收。
[0027] 实施例2人IgGl重链恒定区Fc段基因片段的克隆
[0028]设计引物C:5，GAGCCCAAATCTTGTGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAA3，，弓I 物D:5,AGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA3,；
[0029]设计引物linker-C:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGC GGCAGCGAG。
[0030] WIgGlFc/Teasy载体质粒为模板，分别WC和D为引物、WLinker-C和D为引 物，进行RT-PCR反应，94°C变性 5min开始循环，94°C20sec，62°C30sec，72°C2min，共 35 个循环，最后72°C延伸lOmin。扩增得到编码人IgGl化和对照linker-IgGl化的基因片段。 阳〇3U实施例3TNFR75-FC融合基因的获得
[0032] 1、PCR扩增编码riiTNFR-Fc融合蛋白/riiTNFR-linker-Fc的全长基因片段 阳03引WSTNFR75PCR扩增产物和人IgGlFc段PCR扩增产物为模板，WA:5'TCAAGCTT ATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3,和D:5,AGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA3'为引物，进行RT-PCR反应。
[0034] 同时WsTNFR75-linkerPCR扩增产物和人linker-IgGlFc段PCR扩增产物为模 板，A:5,TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3,和D:5,AGTGAATTCTCATTT ACCCGGAGACAGGGA3' 为引物，进行RT-PCR反应。
[0035]RT-PCR扩增反应步骤：94°C变性 5min开始循环，94°C40sec，62°C30sec， 70°CImin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。
[0036] 扩增得到riiTNFR-Fc和riiTNFR-linker-Fc融合蛋白的全长cDNA片段，其基因片 段长分别为1470b