一种金属硫蛋白基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基因，具体是从四膜虫Tetr址ymenaelliotti中克隆的金属硫蛋 白基因，含有该基因的重组工程菌在水体环境中重金属污染治理方面具有重要应用前景。
【背景技术】
[0002] 金属对环境的严重威胁正逐渐成为全球性问题，重金属在水体中积累到一定的 限度就会对水体-水生植物-水生动物系统产生严重危害，并可能通过食物链直接或间接 地影响到人类的自身健康。如何科学有效地解决重金属对水体的污染已经成为研究的热 点。目前用于治理水体重金属污染的化学法、物理化学法都将产生污染转移，易造成二次污 染，且对于大流域、低浓度的有害重金属污染难W处理。
[0003] 而生物法具有效果好、投资少及运作费用低、易于管理和操作、不产生二次污染等 优点，日益受到人们的关注。近年来，微生物和基因工程技术逐渐用于水环境重金属污染的 治理，并在水体环境中重金属污染的治理方面发挥着越来越重要的作用。如何提高重组工 程菌吸收重金属离子的能力，是治理水环境重金属污染所面临的重要问题。
[0004] 四膜虫MTs在金属硫蛋白超家族分类系统中位于第7家族，四膜虫金属硫蛋白基 因中没有内含子，因此可W快速地响应外界环境胁迫并加快蛋白表达。四膜虫是一种单细 胞真核模式生物，无细胞壁，对于外源环境污染物胁迫敏感，具有快速的细胞响应机制，因 此被认为是毒理学与生态毒理学研究良好的模式生物之一。 阳〇化]目前，国内外已经有将植物，动物金属硫蛋白转入大肠杆菌中用于治理水环境 重金属污染的报道，重组华溪蟹金属硫蛋白的工程菌可吸收0. 467X10 4mol/g水体中的 CcT;重组黄瓜类金属硫蛋白的工程菌可吸收1.25X10 4mol/g水体中的CcT。但本发明 将四膜虫Tetr址ymenaelliotti中克隆得到的一种金属硫蛋白基因构建的工程菌化21/ pSUM0-Te-MTT2可吸收3. 89X10 4mol/g水体中的CcT，与之前报道相比，富集重金属离子的 能力更强。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种新的金属硫蛋白基因，提供一种含有金属硫蛋白基因 可吸收重金属离子的基因工程菌，W及它们在富集水体重金属中的应用。 阳007] 本发明提供的一种金属硫蛋白基因，其核巧酸序列为SEQIDNO: 1。
[0008] 一种金属硫蛋白突变基因灯e-MTT2)，其核巧酸序列为SEQIDN0:2。
[0009] 上述突变基因编码的多肤，其氨基酸序列为SEQIDNO:3。
[0010] 一种重组质粒pSUM0-Te-MTT2,含有所述的突变基因。
[0011] 一种重组基因工程菌，是将上述重组质粒转化到大肠杆菌得到的重组菌。
[0012] 本发明含金属硫蛋白基因（Te-MTT2)的工程菌的构建方法，包括如下步骤： 阳01引 （1)从四膜虫Tetr址ymenaelliotti中克隆得到MTT2基因，分别在Te-MTT2的 5'端和3'端加上BamHI和化0I酶切位点；并通过PCR方法突变基因序列中的两个大 肠杆菌终止密码子；将突变后的Te-MTT2基因连接到表达载体pSUMO中，获得重组质粒pSUM0-Te-MTT2；
[0014] (2)将重组质粒pSUM0-Te-MTT2转入大肠杆菌化21，用IPTG诱导表达出目的蛋白 SUM0-Te-MTT2,并用Westernblot的方法检测蛋白的表达；
[00巧]检测实验：使用不同浓度的CcT处理经IPTG诱导后的大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2,检测ODe。。的数据，并构建剂量构效关系，对照为相同条件下处理的大肠杆 菌化21/pSUMO,每组实验S个平行。
[0016] 用X射线巧光光谱仪检测大肠杆菌化21/pSUMO和大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2 经IPTG诱导后馨合CcT的能力，每组S个平行。
[0017] 实验表明，本发明所提供的含有Te-MTT2基因的基因工程菌具有馨合水环境中金 属离子的能力，反应快速，高效，可在处理重金属（儒、銅、铅或隶）污水中应用。所述的突 变基因及其编码的多肤也可在重金属污染修复中应用。
【附图说明】 阳0化]图1重组质粒pSUM0-Te-MTT2的鉴定。（Mr为Trans2KDNAMarker;泳道1为重 组质粒pSUM0-Te-MTT2;泳道2为Te-MTT2的PCR产物；泳道3为重组质粒pSUM0-Te-MTT2 的BamHI和化0I的双酶切鉴定）
[0019] 图2重组质粒pSUM0-Te-MTT2的构建示意图。
[0020] 图 3 目的蛋白SUM〇-Te-MTT2 表达情况的检测。（Mr为PremixedProteinMarker; 泳道1为化21/SUM0-Te-MTT2在0. 05mMIPTG诱导时表达的全菌蛋白；泳道2为化21/ SUM0-Te-MTT2未诱导表达的全菌蛋白；泳道3为化21/SUM0-Te-MTT2在0. 05mMIPTG诱导 时表达的可溶蛋白）
[0021] 图4Westernblot检测目的蛋白SUM0-Te-MTT2的表达。（泳道1为化21/SUM0 全菌，泳道2为化21/SUM0上清；泳道3为化21/SUM0-Te-MTT2未诱导的全菌蛋白；泳道4 为化21/SUM0-Te-MTT2未诱导的上清蛋白；泳道5为化21/SUM0-Te-MTT2在IPTG诱导下全 菌蛋白；泳道4为化21/SUM0-Te-MTT2在IPTG诱导下的上清蛋白）
[0022] 图 5Cd2+处理大肠杆菌BL21/祀-SUMO和BL21/pSUM0-Te-MTT2 后，0D6。。一C(T浓 度关系图。
[0023]图 6 大肠杆菌BL21/pSUM0 和BL21/pSUM0-Te-MTT2 富集Cd2+比较。
【具体实施方式】
[0024] 实施例1金属硫蛋白Te-MTT2基因的扩增、突变和重组质粒pSUM0-Te-MTT2的构 建及鉴定 阳0对设计引物：
[0026] (1)克隆基因Te-MTT2设计的引物：
[0027]Te-MTT2-F：GGATCCATGGACCCTCAAACTCAAAATA
[0028]Te-MTT2-R：CTCGAGTCAGCATTTGCATTCTGAGCA
[0029] (2)基因Te-MTT2突变终止密码子设计的引物：
[0030] 突变第一个终止密码子的引物
[0031] l'ubian-Te-MTT2-F-l :GCAACTGTCAACCTTGTGAAAACTG
[0032] l'ubian-Te-MTT2-R-l :CAGTTTTCACAAGGTTGACAGTTGC
[0033] 突变第二个终止密码子的引物
[0034] l'ubian-Te-MTT2-F-2 :CTGAAAATTGCCAATGCAACCCTTG
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