来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因的制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，属分子生物学应用技术领域。
【背景技术】
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[0002]烟草是我国重要的经济作物，在生长过程中易受到病虫害的侵染，病害的发生严重影响了烟草的产量和质量。
[0003]近年来，烟草黑胫病的发生愈加严重，危害程度仅次于烟草病毒病，是烟草生产上最具毁灭性的病害之一。
[0004]烟草疫霉(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)是引起烟草黑胚病的病原菌，其在侵染烟草时，首先分泌多聚半乳糖酸酸酶(Polygalacturonases, PGs),降解烟草的细胞壁，引起病害；烟草在受到病原物的侵染后，启动自身的防御系统，抵抗侵染；其中，多聚半乳糖酸酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-1nhibiting Proteins, PGIPs)能够特异性与PGs结合，降低其水解活性，提高植物的抗病性。
[0005]PGIPs最初在1971年由Albersheim等在菜豆下胚轴、番爺莖和桐叶槭悬浮培养细胞中发现，随后在苹果、豌豆、黄瓜、小麦、马哈利樱桃、棉花、桃等植物上分离到了能够抑制PGs活性的PGIPs。
[0006]研究发现，PGIPs可以特异性抑制病原真菌和昆虫分泌的PGs，可引起高浓度长链寡聚半乳糖酸酸(oligogalacturonides, OGs)的积累，激活寄主的防御系统,调控基因的表达，有效地阻断病菌侵染和抑制相应病程的发生与发展，增强寄主的抗病性。
[0007]研究表明，PGIPs蛋白的一级结构具有LRRs结构域，存在不同程度的糖基化，并在N端和C端存在4个高度保守的半胱氨酸残基。PGIPs的含量和分布，在时间、空间、品种和组织细胞中存在较大差异，并受到病原物、昆虫、机械损伤及水杨酸等因子的影响。
[0008]数据表明，PGIPs由复杂的多基因家族组成，且PGIPs家族的不同成员具有几乎相同的生化性质，但与不同真菌的PGs相互作用的能力不同。随后研究发现将外源PGIPs基因整合到植物基因组中，可提高植物的抗病性。
[0009]目前，PGIPs基因作为抵抗真菌病害的有效抗病基因，受到了国内外学者的青睐。将PGIPs基因转入目的植物，增强植物的抗病性，抑制病害的发生，减少农药的使用，已成为世界各国亟待解决的问题。
【发明内容】
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[0010]为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，并诱导其表达提高植物的抗病性。
[0011 ] 本发明是通过如下技术方案来实现上述目的的。
[0012]1、烟草多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因的克隆
[0013]烟草NtPGIP基因的克隆过程为:烟草品种为小黄金，采用CTAB法提取其基因组DNA ;按照Trizol试剂说明书提取其总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA ;根据GenBank已报道植物的PGIPs基因设计简并引物，PCR扩增获得NtPGIP基因片段；然后采用3’ RACE和5’ RACE技术获得NtPGIP全长基因。
[0014]对所克隆的NtPGIP基因进彳丁 DNA测序，其DNA序列如下:
[0015]序列表SEQ ID NO:1
[0016]〈110〉长江大学
[0017]〈120〉来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因
[0018]〈130〉2014
[0019]〈160〉14
[0020]〈170〉PatentIn vers1n 3.3
[0021]〈210〉I
[0022]〈211〉1412
[0023]〈212〉DNA
[0024]〈213〉 Nicotiana tabacum
[0025]〈400〉I
[0026]ccattaatag aagtattgaa tttgcttcta agttccctga tattatcacc aataagaccc60
[0027]agcttcaaca attcctagga agcttaaatt atatttctccctttataaag gatttagcca 120
[0028]aagatacttc tcttctttat gatggattga agaagaatccgaaagcttgg actgatagtc 180
[0029]atacaaatgc ttcataaaat gaaaacctct gtagtttcccttctttattt ttcgttcttc 240
[0030]ttcctttctc aattctccac atctctctct gaaagatgca atccaaatga caaaaaagcc 300
[0031]ctcctagaaa tcaagaaagg cctaggcaat ccctatgacttgatcacatg ggatccaaaa 360
[0032]accgattgtt gtactgattg ggttgaagcc actctctcatgtgatgacaa aaacaatcgt 420
[0033]gttacttcct taaacctctt taaaattgaa gacgttggctacctctcgcc cgcgttcgga 480
[0034]gacttgccgt atctccaaag tttggacatc aataatgtgcgcaatctctc aggtccaatt 540
[0035]ccgcccacaa ttgccaaact ctcaaagctc acattcttga gaattagtca aacaaacatt 600
[0036]tcaggaccag tccctggatt tcttagtaag ttgaaaaaactaacatacat caacttgtca 660
[0037]tacaataaac tcgttggtac tatccctcct ccactttctcagctgtcaaa tctcgagttc 720
[0038]cttggtttag acaggaacaa acttactgga ccaatcccag aatccttcgg taactttgct 780
[0039]ggaaaactca cgtatcttta ccttggccac aaccaattaa ccgggtctgt gcctaaatct 840
[0040]tttggtggtt ggagtcttga gacaattgac ttgtctggaa acatgcttga aggagatatt 900
[0041]tctttcttgt ttggcaaaga taagacaaca tttcaaatgcttttagatca taataagttt 960
[0042]gcattcgact tctcgaaggc aaagtttggg aaaagattatggaggttgga cttgaaccat 1020
[0043]aataaaattt atgggaatct tccagcagct ataacgaaacaaccatggca gcttttcaac 1080
[0044]gtgagttata acaggctttg tgggaagatt ccacaaggtg gggaaataaa gaattatgat 1140
[0045]atttatgttt atctccacaa caaatgcttg tgtgactctccgttgccacc ttgtaaatcg 1200
[0046]tgatgatttg ctgtcatttc tttgagaaat aagagtggatagtctactcc gtgtttttgt 1260
[0047]ggtcctaaat ctatttatgt atttgaacct ttctctttgtatgtcaatag gccagcaaac 1320
[0048]ttaagatgag gctgcctaat aagtcaagat gtgatttaag aatgacaaag ctcattgtgt 1380
[0049]
[0050]烟草NtPGIP基因cDNA全长1412 bp，包含一个长186 bp的5’UTR和长209bp的3’ UTR区域，其开放阅读框从187bp-1200bp，长1017bp。
[0051]NtPGIP基因编码蛋白质的氨基酸序列如下:
[0052]序列表SEQ ID NO:2
[0053]〈210〉2
[0054]〈211〉 338
[0055]〈212〉PRT
[0056]〈213〉 Nicotiana tabacum
[0057]<400> 2
[0058]Met Leu His Lys Met Lys Thr Ser Val Val Ser Leu Leu Tyr Phe Ser
[0059]151015
[0060]Phe Phe Phe Leu Ser Gln Phe Ser Thr Ser Leu Ser Glu Arg Cys Asn
[0061]202530
[0062]Pro Asn Asp Lys Lys Ala Leu Leu Glu He Lys Lys Gly Leu Gly Asn
[0063]3540 45
[0064]Pro Tyr Asp Leu He Thr Trp Asp Pro Lys Thr Asp Cys Cys Thr Asp
[0065]5055 60
[0066]Trp Val Glu Ala Thr Leu Ser Cys Asp Asp Lys Asn Asn Arg Val Thr
[0067]6570 7580
[0068]Ser Leu Asn Leu Phe Lys He Glu Asp Val Gly Tyr Leu Ser Pro Ala
[0069]859095
[0070]Phe Gly Asp Leu Pro Tyr Leu Gln Ser Leu Asp He Asn Asn Val Arg
[0071]100105110
[0072]Asn Leu Ser Gly Pro He Pro Pro Thr He Ala Lys Leu Ser Lys Leu
[0073]115120 125
[0074]Thr Phe Leu Arg He Ser Gln Thr Asn He Ser Gly Pro Val Pro Gly
[0