靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，设及一种针对小鼠神经干细胞UCP2基因的RNAi 重组慢病毒表达载体，W及该表达载体的构建。本发明所述重组慢病毒可应用于神经管崎 形发病机制的研究中。
【背景技术】
[0002] 神经管崎形（NeuralTubeDefects,NTDs)是指W中枢神经系统为主要发病部位 的先天性出生缺陷疾病，我国山西省发病率最高，统计结果高达19. 9%。。NlDs的高发现象， 成为全球许多国家和地区婴儿终生残疾与死亡的主要原因。
[0003] 神经管的关闭过程受到基因的严格控制W及环境因素调节。根据申请者近年的研 究结果W及文献检索，解偶联蛋白2(uncouplingprotein2，UCP2)与神经管崎形的关系在 人群调查研究中已经得出了初步相关结论，提示UCP2基因为NT化的候选基因。基于上述 结论，申请者欲利用小鼠神经干细胞（更接近于早期胚胎神经管细胞）证明UCP2与NlDs 发生之间的联系，及探索其引起神经管崎形的机制。神经干细胞是一种利用常规方法难于 转染的细胞，因此急需利用一种转染效率更高的方法来满足后续实验的研究。上述技术平 台的建立，将提供一个UCP2基因功能研究模型，并在后续机制研究中发挥重要作用。但目 前对于小鼠神经干细胞UCP2基因的siRNA还未见研究报道。
[0004] RNA干扰（RNAU是利用双链RNA高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使目的基 因mRNA降解而发生基因沉默的过程。RNAi在起始阶段，W各种方式（电转、病毒感染等）引 入的双链RNA(dsRNA)被Dicer酶逐步切割为21~23nt的小分子干扰RNA片段（SiRNA)。 SiRNA双链与核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合物巧ISC)，RISC中SiRNA变性，正义 链脱离，反义链仍结合在复合物上并引导RISC与同源祀目标RNA结合，诱导祀mRNA降解， 从而阻断基因表达。SiRNA还可W作为一种特殊的引物，在RNA依赖的RNA聚合酶作用下， W祀mRNA为模板合成dsRNA分子，后者又可W进入上述循环。新生的dsRNA反复合成与降 解，不断形成新的SiRNA,使祀mRNA不断减少，导致目的基因沉默，呈现RNAi现象。
[0005] SiRNA是RNA干扰的主要效应物。至今哺乳动物细胞RNAi技术路线可W通过两 种方式进行：1)直接制备21~23nt的SiRNA片段，将SiRNA转入哺乳动物细胞。2)将短 发夹结构RNA(shRNA)的DNA表达载体转入细胞，表达产生shRNA，经过Dicer切割后得到 SiRNA。前者不适于长时间的研究项目，而后者可持续较长时间，有利于后续的实验开展。
[0006] RNAi抑制基因表达作用在很大程度上受到转染方式、转染效率的限制，解决问题 的关键是选择合适的载体导入细胞。目前SiRNA的导入方式有=种，1)化学合成siRNAs 转染干扰，2) ShRNA表达载体法，3)病毒载体法。前两种方法感染效率低，尤其是针对脂质 体干扰效果差的细胞，如神经干细胞。
[0007] 慢病毒载体是WHIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，其对分裂细胞和非分裂 细胞均具有感染能力，目前被广泛应用于表达RNAi的研究中。与质粒载体及其他病毒载体 相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。
【发明内容】
阳00引本发明的目的是提供一种祀向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种祀向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的RNA干 扰重组慢病毒载体，W有效抑制小鼠原代神经干细胞中UCP2基因的表达。
[0010] 本发明所述祀向抑制小鼠神经干细胞UCP2基因表达的siRNA具有SeqIDNo. 1 所示的核巧酸序列，记为LVT818。 W11] 本发明根据上述设计的SiRNA序列，合成了两条编码shRNA的DNA模板单链，所述 编码shRNA的DNA模板单链分别为具有SeqIDNo. 2所示核巧酸序列的正义链和具有Seq IDNo. 3所示核巧酸序列的反义链，由5'黏末端+19nt祀序列+茎环结构+祀序列互补序 列+转录终止位点+3'黏末端结构构成。 阳01引 LVT818-1 (正义链）： 5 >-CcggCCTAATGGCTGCCTACCAAcTCAAGAGATTGGTAGGCAGCCATTAGGTTTTTTg-3>。 阳01引 LVT818-2(反义链）： 5，-aattcaaaaaaCCTAATGGCTGCCTACCAATCTCTTGA巧TGGTAGGCAGCCATTAGG-3，。
[0014] 本发明还提供了包含所述ShRNA的RNA干扰重组慢病毒载体，是在自身失活的第 二代慢病毒载体pMagic4. 1的多克隆位点连接所述shRNA后构建的载体P化-EGFP/CMV/ WPRE加3-sh恤CP2。
[0015] 具体的构建方法是将所述编码ShRNA的DNA单链退火形成双链DNA片段，连接 到pMagic4. 1慢病毒载体（上海sbo-bio公司）的多克隆位点中，构建重组慢病毒载体 P化-EGFP/CMV/WPRE加3-shmUCP2,再W所述重组慢病毒载体联合第二代慢病毒包装质粒 pCD/化-BH蝴孤和膜蛋白表达质粒pLTR-G(均购自Addgene)共转染293T细胞，获得所述包 装的重组慢病毒载体。
[0016] 其中，所述构建方法中，是在所述DNA片段的末端引入与心e巧日仍口乐/酶切载 体位点相连接的黏末端，并W心e巧R 酶切pMagic4. 1载体，回收大片段与所述双链 DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。
[0017] 本发明所构建的RNA干扰重组慢病毒载体可W应用于抑制小鼠神经干细胞UCP2 基因表达上，W有效抑制神经干细胞中UCP2基因表达。
[001引本发明提供了一种能够特异性沉默小鼠UCP2基因的SiRNA序列，通过体外转染实 验证实，该序列能够有效抑制小鼠原代神经干细胞中的UCP2基因表达。本发明进一步构建 了能够稳定表达上述SiRNA序列的重组慢病毒载体，并在293T细胞中生产出具有高感染率 的该重组慢病毒。通过体内感染实验，该高效稳定表达UCP2基因shRNA序列的重组慢病毒 能够明显抑制原代神经干细胞的UCP2基因表达。上述研究结果为进一步研究UCP2基因在 神经管崎形发生过程中的作用提供了细胞模型。
[0019]本发明采用的pMagic4. 1载体含有U6启动子，能够在宿主细胞中持续表达有干 扰作用的小RNA。同时，该质粒能够表达由CMV启动子驱动的巧光蛋白EGFP，方便病毒包装 时转染效率，W及感染宿主细胞时感染效率的检测。本发明采用的第二代慢病毒包装质粒 pCD/化-BH蝴DD和膜蛋白表达质粒pLTR-G提供了病毒包装所需的酶和蛋白。将W上载体共 转染293T细胞，能够高效组装自身失活的慢病毒载体。使用辅助质粒包装病毒无需感染性 的腺病毒，而且只使用两个质粒就提高了转染效率和载体的产出。
[0020] 与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，利用慢病毒构建的 shRNA载体具有W下优点：一方面可W扩增替代瞬时表达载体使用，转入祀细胞后可W插 入宿主细胞基因组中并稳定表达，不会导致插入失活；另一方面，该病毒载体可用于感染传 统转染试剂难于转染的非分裂细胞系如原代神经干细胞，并且在感染后可W整合到受感染 细胞的基因组，进行长时间的稳定表达，而前期其他传统形式的转染实验都无法达到预期 目标。本发明将目的基因整合至祀细胞基因组长时程表达、免疫反应小，是一种比较理想的 用于导入神经干细胞，用于UCP2基因在神经干细胞中沉默的干扰载体。
[0021] 本发明利用失活慢病毒载体携带UCP2RNA干扰片段的DNA模板，其在体内转录成 shRNA，完美的解决了RNA干扰的祀向性、安全性W及表达持续性的问题。
【附图说明】
[0022] 图1是pMagic4. 1慢病毒载体的结构示意图。
[0023] 图2是病毒感染神经干细胞的巧光显微镜观测结果。
[0024] 图3是病毒感染神经干细胞7化后对小鼠UCP2基因mRNA表达干扰的效果图。 阳0巧]图4是病毒感染神经干细胞7化后对小鼠UCP2基因的蛋白Western-blot检测结 果。 阳0%] 图5是病毒感染神经干细胞7化后对小鼠UCP2基因的蛋白Western-blot检测结 果灰度值扫描。
【具体实施方式】
[0027] W下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。 阳02引实施例1 :设计祀向抑制小鼠UCP2基因表达的SiRNA序列。
[0029] 根据小鼠神经干细胞UCP2基因的mRNA序列（NM_011671)，设计一组针对mUCP2基 因表达的SiRNA序列及对照SiRNA序列，并从中筛选出一个干扰效果最佳的SiRNA序列，命 名为LVT818。
[0030] 具体的SiRNA序列如下，其中LVT818为有效干扰片段组，LVT4为阴性对照组。
[0031] LVT818 :5' -CCTAATGGCTGCCTACCAA-3' ;GC52. 6〇/〇。
[0032]LVT4 :5, -TTCTCCGAACGTGTCACGT-3, ；GC52.6〇/〇。
[003引实施例2蟲核巧酸的设计及合成。
[0034]W上述实施例1设计的SiRNA序列设计合成shRNA的正义链和反义链。所述shRNA 中的Loop结构选用了 "cTCAAGAGA"和"TCTCTTGAg"，并分别在5'端加上心e巧P公CO乐/ 酶切位点黏末端，由Invitrogen公司合成序列，具体的shRNA序列如下。
[0035] LVT818-1 (正义链）： 5> -CcggCCTAATGGCTGCCTACCAAcTCAAGAGATTGGTAGGCAGCCATTAGGTTTTTTg-3^〇
[0036] LVT818-2 (反义链）： 5, -aattcaaaaaaCCTAATGGCTGCCTACCAATCTCTTGAgTTGGTAGGCAGCCATTAGG-3'〇
[0037]LVT4-1 (正义链）： 5，-Ccg巧TCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg-3，。
[0038]LVT4-2 (反义链）： 5' -aattcaaaaaTTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA