一种牛肌肉增强子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地说，设及一种牛肌肉增强子及其应用。
【背景技术】
[0002] 在1978年，Reddy等人首次发现在猿猴病毒基因组中有增强子序列，1981年 Banerji等人发现运段序列对于病毒的生存和繁殖是必需的调节序列，有显著的增强基因 转录的作用，故称之为"增强子"。
[0003] 第一个真核增强子是Grosschedl和Birnstiel首次发现的。在真核基因表达调控 中，增强子是非常重要的顺式作用元件，与启动子协同作用，对调控真核基因的表达具重要 作用。增强子一般由两个W上的增强子元件组成，有增强转录的作用。增强子具有两大作 用特点：（1)无方向性，即不管增强子位于启动子上游或下游，均能激活其相应启动子；（2) 增强子对启动子的作用，不受两者之间距离的影响。
[0004] 自1978年W来，已证实在许多生物基因组中都有增强子。由此可W推测增强子是 基因调节中的一种普遍现象。增强子在基因活动中的调节作用不仅与调苄基因表达的速率 有关，同时其作用还具有组织特异性，运掲示了基因调节中的"质和量"的关系。进一步的 研究将主要集中在增强子的作用机制，W及怎么能更好的结合增强子作用的特点来应用增 强子。 阳0化]在制备转基因牛构建基因过表达载体时往往需要在载体中加入增强子序列，W提 高外源基因在牛中的表达，但是目前所应用的增强子多为小鼠的序列，并没有牛本身的序 列，降低了转基因牛的安全性。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种牛肌肉增强子及其应 用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种牛肌肉增强子，其核巧酸序列如SEQ IDNo. 1 所示。
[0008] 本发明还提供了用于扩增所述增强子的引物对，所述引物对的核巧酸序列分别如 沈QIDNo. 2和沈QIDNo. 3所示。
[0009] 本发明还提供了含有所述增强子的载体。
[0010] 本发明还提供了含有所述增强子的重组质粒。
[0011] 本发明还提供了所述重组质粒的构建方法，包括如下步骤： 阳〇1引 1)将权利要求1所述的增强子和pGLS-promoter载体用BamHI和SalI限制性 内切酶酶切；
[0013] 2)电泳后切胶回收酶切产物；
[0014] 3)将增强子序列和pGL3-promoter载体用T4连接酶连接过夜；
[0015] 4)将连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后倒置培养；
[0016] 5)挑取单克隆，在LB培养板中划线，倒置培养，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测进 行菌体鉴定；
[0017] 6)对PCR阳性菌落进行DNA测序；
[0018] 7)将符合预期的菌落转接到LB培养基中，摇床培养；
[0019] 8)使用去内毒素质粒DNA制备试剂盒制备得到重组质粒。 阳020] 进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
[0021] 1)将所述的增强子和pGLS-promoter载体（PromegaE1761)用BamHI和SalI 限制性内切酶酶切；
[0022] 2)电泳后切胶回收酶切产物；
[0023] 3)将增强子序列和pGL3-promoter载体于4°C用T4连接酶（肥BM0202L)连接过 夜；
[0024] 4)将连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后，37°C倒置培养12h;
[00巧]5)挑取单克隆，在LB培养板中划线，37°C倒置培养化后，通过PCR和琼脂糖凝胶 电泳检测进行菌体鉴定；
[0026] 6)对PCR阳性菌落进行DNA测序；
[0027] 7)将符合预期的菌落转接到LB培养基中，在37°C摇床22化pm进行培养；
[0028] 8)使用去内毒素质粒DNA制备试剂盒（OmegaD6950-01)制备得到重组质粒。将 制备出的质粒命名为PGL3-1357。
[0029] 本发明还提供了所述增强子在成肌细胞中增强启动子转录活性方面的应用。
[0030] 进一步地，所述应用为将前述载体或前述重组质粒转入成肌细胞中。
[0031] 本发明的有益效果在于：
[0032] 本发明获得一种新的牛源的肌肉增强子，利用巧光素酶报告系统发现该增强子能 在分化的C2C12细胞中显著增强启动子转录活性，为今后制备转基因牛提供了一种新的选 择。
【附图说明】 阳03；3] 图1为本发明实施例3所述的分化6天后用Dual-Glo饭Luc if erase assay (Promega E2920)试剂盒检测蛋火虫巧光素酶/海参巧光素酶相对巧光量的检测结 果。
【具体实施方式】
[0034] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 阳03引实施例1PCR扩增牛肌肉增强子序列
[0036] 提取安格斯牛的基因组DNA，W其为模板（浓度为80ng/ul);用Q5超高保真DNA 聚合酶（肥B，M0491L)和特异性扩增引物对进行PCR扩增，得到牛肌肉增强子序列（其核巧 酸序列如SEQIDNo. 1所示）。
[0037] PCR扩增程序如表1所示，PCR反应体系如表2所示。
[003引所述特异性扩增引物对如下：
[0039] 上游引物序列（含有BamHI酶切位点和保护碱基）：ATCGGGATCCGCCAAGATAAGGTT GGGACA；
[0040]下游引物序列（含有SalI酶切位点和保护碱基）：ATCGGTCGACTTTAAACCCCCTCAC CCTTCo 柳41]表1PCR扩增程序[0042]
阳0创表2 PCR反应体系[0044]
W45] 实施例2构建含有本发明增强子序列的PGL3巧光素酶报告载体
[0046] 1)将实施例1扩增出的增强子序列和pGLS-promoter载体（PromegaE1761)用 BamHI和SalI限制性内切酶酶切；
[0047] 2)电泳后切胶回收酶切产物；
[0048] 3)将增强子序列和载体于4°C用T4连接酶（肥B M0202L)连接过夜；
[0049] 4)使用连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后，37°C倒置培养1化左右；
[0050] W挑取单克隆，在LB培养板中划线，37°C倒置培养化后进行菌体PCR鉴定。通过 PCR和琼脂糖电泳检测扩增结果；
[0051] 6)对PCR阳性菌落进行DNA测序；
[0052] 7)将符合预期的菌落转接到LB培养基中，在37°C摇床22化pm进行培养；
[0053] 8)用去内毒素质粒DNA制备试剂盒（OmegaD6950-01)来制备质粒。将制备出的 质粒命名为PGL3-1357。
[0054] 实施例3牛肌肉增强子的功能验证
[0055] 1、待C2C12细胞的汇合度为60 % -70 %时，利用脂质体2000 (11668-019， Invitrogen)在C2C12 细胞中分别共转PGL3-1357 和P化-TK(E2241)、pGL3-promoter和 P化-TK，待细胞汇合度达到90%时，将细胞用分化培养基培养，诱导细胞分化6天。
[0056] 所述分化培养基为含有2 %马血清和1 %青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。
[0057] 用分化培养基培养的条件为：37°C，5%C02。
[0058] 2、分化 6 天后用'Dual-Glo饭Luciferaseassay(PromegaE2920)试剂盒检测蛋 火虫巧光素酶和海参巧光素酶，用蛋火虫巧光素酶/海参巧光素酶的比值来说明增强子是 否起作用，如图1所示，本发明所发现的增强子有约11倍的增强效果。
[0059] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种牛肌肉增强子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。2. 用于扩增权利要求1所述增强子的引物对，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列 分别如SEQIDNo. 2 和SEQIDNo. 3 所示。3. 含有权利要求1所述增强子的载体。4. 含有权利要求1所述增强子的重组质粒。5. 权利要求4所述重组质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将权利要求1所述的增强子和pGL3-promoter载体用BamHI和SalI限制性内切 酶酶切； 2) 电泳后切胶回收酶切产物； 3) 将增强子序列和pGL3-promoter载体用T4连接酶连接过夜； 4) 将连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后倒置培养； 5) 挑取单克隆，在LB培养板中划线，倒置培养，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳检测进行菌 体鉴定； 6) 对PCR阳性菌落进行DNA测序； 7) 将符合预期的菌落转接到LB培养基中，摇床培养； 8) 使用去内毒素质粒DNA制备试剂盒制备得到重组质粒。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 将权利要求1所述的增强子和pGL3-promoter载体用BamHI和SalI限制性内切 酶酶切； 2) 电泳后切胶回收酶切产物； 3) 将增强子序列和pGL3-promoter载体于4°C用T4连接酶连接过夜； 4) 将连接完成的产物转化大肠杆菌，涂板后，37°C倒置培养12h; 5) 挑取单克隆，在LB培养板中划线，37°C倒置培养8h后，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳 检测进行菌体鉴定； 6) 对PCR阳性菌落进行DNA测序； 7) 将符合预期的菌落转接到LB培养基中，在37°C摇床220rpm进行培养； 8) 使用去内毒素质粒DNA制备试剂盒制备得到重组质粒。7. 权利要求1所述增强子在增强启动子转录活性方面的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述载体或权利要求4所述 的重组质粒转入成肌细胞中。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种牛肌肉增强子及其应用。所述牛肌肉增强子的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。其能够特异性的显著增强成肌细胞中启动子的转录活性。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/85, C12N15/113, C12N15/66
【公开号】CN105200058
【申请号】CN201510671543
【发明人】孟庆勇, 王萌, 畅雯
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月16日