一种人重组Irisin蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域中重组基因的可溶性表达和纯化方法，特别设及人 Irisin蛋白的原核表达和纯化方法。
【背景技术】
[0002] Irisin是2012年年初由Spiegelman实验室在《自然》杂志上报道的一种新 的肌肉因子，是蛋白水解酶剪切III型纤连蛋白组件包含蛋白5(fibronectintypeIII domain-containingprotein5，FNDC5)后形成的可分泌多肤片段。人FND巧的N-端有 一个信号序列，中间为III型纤连蛋白结构域（FND)，紧接其后的为疏水氨基酸区和C-末端。 Irisin是FND巧中纤连蛋白结构域的主要部分，是由112个氨基酸残基组成的N-糖基化蛋 白质激素，其序列在种属间高度保守，人和小鼠的Irisin氨基酸序列同源性为100%。
[0003] 发现者用希腊神话中信使女神Iris的名字为Irisin命名，暗喻其像Iris-样， 作为骨骼肌的使者，传递骨骼肌的信号，并连接骨骼肌与外周组织的关系。Irisin最重要的 生物学功能是通过内分泌、旁分泌和自分泌的方式作用于白色脂肪细胞，使后者转变为具 有分解代谢脂肪特征的栋色脂肪细胞，W产热的方式消除白色脂肪，从而起到减肥作用。研 究表明，尊尾素水平主要反映了肌肉质量，且在年轻的男性运动员中其量高于老年女性；另 有研究表明，II型糖尿病患者的血清Irisin水平是降低的，并且与新发II型糖尿病的发 病率呈反比，表明Irisin可能在糖耐量和II型糖尿病中发挥关键作用；此外，有关报道还 指出Irisin与非酒精性脂肪肝、屯、率衰竭等病理现象存在一定的相关性。
[0004] 可W看出Irisin必将是一个很有前景的活性因子，并成为代谢性疾病及其并发 症防治的新祀点，有非常大的潜在价值。因此，开发Irisin蛋白的可大规模生产并便于纯 化的方法，具有非常大的价值。
【发明内容】
[00化]发明目的：本发明的第一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的DNA序列。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供一种人Irisin重组蛋白。
[0007] 本发明的又一个目的是提供含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表 达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。
[0008] 本发明的又一个目的是提供一种转基因重组菌。
[0009] 本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白的制备方法。
[0010] 本发明的又一个目的是提供一种人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应 用。
[0011] 技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种人Irisin重组蛋白 的DNA序列，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。 阳01引一种人Irisin重组蛋白，其氨基酸序列如沈QIDNO:2所示。
[0013] 含有所述的人Irisin重组蛋白的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转 基因重组菌。
[0014] 将所述的DM序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达人Irisin重组蛋白的 DNA的重组表达载体。
[0015] 其中，所述大肠杆菌表达载体为祀T-30a(+)。
[0016] 一种转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选 得到转基因重组菌。
[0017] 所述的DNA序列、重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产人 Irisin重组蛋白中的应用。
[0018] 一种人Irisin重组蛋白的制备方法，包括W下步骤：
[0019] 1)从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA，WcDNA为模板，PCR 得到人Irisin的基因片段，其碱基序列如SEQIDNO:1所示；
[0020] 2)构建祀T30a-Irisin原核表达载体；
[0021] 3)构建Rosetta-pET-30a-I;risin原核表达菌株；
[0022] 4)人Irisin重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定。
[0023] 一种所述的人Irisin重组蛋白在制备代谢性疾病药物的应用。
[0024] 有益效果：本发明相对于现有技术，具有W下优点：本发明所提供的方法步骤简 便，生产成本低，生产周期短，通过本发明所提供的方法，可得到纯度较高的特异性目的蛋 白。其最主要优势在于：本发明首次W原核表达体系实现了人Irisin蛋白的可溶性表达， 并且，在用儀柱纯化蛋白的过程中通过咪挫梯度洗脱及抑梯度洗脱，确定了目的蛋白的最 佳洗脱条件，可得到高纯度的目的蛋白。
【附图说明】 阳0巧]图1 :祀T-30a-Irisin载体酶切检验琼脂糖电泳分析图（M为DL5000DNAMaker;1 为经Ndeiahol双酶切的祀T-30a-Irisin载体；2为未经酶切的祀T30a-Irisin载体。可 初步判断祀T-30a-Irisin载体成功构建。）
[0026]图 2 :Rosetta-pET-30a-Irisin菌株IPTG梯度诱导SDS-PAGE电泳分析图（M为 PremixedProteinMarker;图中1所用IPTG诱导剂浓度为OmM;2所用IPTG诱导剂浓度为 0.ImM;3所用IPTG诱导剂浓度为0. 2mM;4所用IPTG诱导剂浓度为0. 4mM;5所用IPTG诱 导剂浓度为0. 6mM;6所用IPTG诱导剂浓度为0. 8mM;7所用IPTG诱导剂浓度为1.OmM;可 看出14KDa左右位置有明显差异，初步判断目的蛋白有表达）
[0027] 图3 :Rosetta-pET-30a-I;risin菌株低溫诱导儀柱纯化SDS-PAGE电泳分析图（M 为PremixedProteinMarker;图中1为诱导菌体；2为诱导菌体裂解上清；3为过柱液；4 为洗涂液I;5为洗涂液II;6为洗脱液；6泳道为纯化目的蛋白，其条带单一且与预测结果 一致，运表明本发明通过纯化得到了较高纯度的目的蛋白）
[0028] 图4:人Irisin蛋白原核表达Westernblot分析图（图中为14邸a位置特异 性条带，其中，1为未经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-Irisin菌体；2为经IPTG诱导的 Rosetta-pET-30a-I;risin菌体；3 为经IPTG诱导的Rosetta-pET-30a-I;risin菌体裂解上 清；4为经儀柱纯化的人Irisin原核表达蛋白。结果表明，目的蛋白成功表达。）
[0029] 图5 :BCA蛋白浓度测定标准曲线。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1 :构建人Irisin蛋白的原核表达质粒和菌株
[0031] 1.从人肌肉组织中的到Irisin的目的基因
[0032] 从人肌肉组织中提取总RNA并做反转录PCR得到其cDNA。根据相关文献报道 及NCBI网上公布Irisin基因序列（NM_153756)设计引物，W上述得到的cDNA为模板，做 PCR得到人Irisin的基因片段。把上述人Irisin基因插入到PMD19-T载体中。命名为 pMD19-T-Irisin，并测序确定正确获取目的基因。
[0033] 2.构建祀T30a-Irisin原核表达载体
[0034] 跟据人Irisin基因序列设计引物，其中上游带有Ndel酶切位点，下游带有化〇1 酶切位点：
[0035]上游引物：5 ' 一TACATATGGACAGTCCCTCAGCCCCA-3 '
[0036]下游引物：5 ' 一CACTCGAGCTCTTTCATGGTTACCTCA-3，
[0037] W步骤1中pMD19-T-Irisin载体为模板，用上述的一对引物进行PCR扩增。 阳03引 PCR体系：