成若干组，置于光照培养箱中，16h/8h光照/黑暗培养，准备接受胁迫处理。
[0141]喷施处理:分别用等量的5mM水杨酸(SA)、100 μ M脱落酸(ABA)、300mM NaCL以及蒸馏水对照混以0.05% Tween20均匀喷施烟草叶面，并用塑料袋套在烟草植株上防止蒸发。
[0142]冷冻处理:将整株烟草放入4°C冰箱中。
[0143]烟草疫霉菌处理:将烟草疫霉在燕麦培养基上培养5-7天后，用打孔器打取直径为0.5cm的菌块，接种于烟草叶片，每个叶片接种4-5块菌块。
[0144]样品处理完成后，除冷冻处理外，其余均放入光照培养箱正常培养，分别隔0h、4h、12h、24h、36h、48h、72h后取样，每个处理3棵植株重复，用液氮速冻，并放入-80°C中保存。
[0145]2) Real-time PCR 反应
[0146]按照Trizol试剂说明书提取上述处理烟草叶片的总RNA,根据M-MLV反转录酶说明书合成cDNA，合成的cDNA于-80°C低温保存。据已克隆到的烟草NtPGIP基因cDNA序列，设计特异性引物RT-PGFl和RT-PGR1，进行Real_timePCR反应；
[0147]引物RT-PGF1,引物序列 ctagaaacat gcttgaagga ga,
[0148]引物RT-PGR1,引物序列 ggcaacggag agtcacacaa。
[0149]Real-time PCR 反应体系:cDNA(l μ L)，AYBR Premix Ex TaqTM(10 μ L)，ROXreference dye II (0.4 μ L)，RT-PGFl (0.4 μ L)，RT-PGRl (0.4 μ L)，ddH20 (7.8 μ L)，总体积20 μ L0 Real-time PCR 反应程序:95°C 30s ；95°C 5s, 58°C 25s，72°C lmin，共 40 个循环。
[0150]以不加模板为空白对照，烟草18S rRNA作为内参，其扩增引物18S-F和18S-R分别如下所示:
[0151]引物18S-F,引物序列 ggatagatca ttgcaattgt tgg,
[0152]引物18S-R,引物序列 ggttcaatgg acttctcgcg ac ；
[0153]结果表明，烟草受到外界胁迫因子影响后，叶片内的NtPGIP表达活性明显增强。
[0154]实施例3:烟草NtPGIP基因抗病功能的验证
[0155]I)烟草NtPGIP基因原核表达载体的构建
[0156]根据已经获得的烟草NtPGIP全长cDNA序列和信号肽预测结果，设计特异性引物P-28-F和P-28-R，用以扩增烟草NtPGIP去除信号肽的部分；
[0157]引物 P-28_F,引物序列 gccgaattcg aaagatgcaa tccaaatga,
[0158]引物 P-28_R,引物序列 ccgaagcttc gatttacaag gtggcag。
[0159]为实现该片段在pET_28a(+)的正确重组和表达，分别在上游引物P_28_F上添加了 EcoR I酶切位点，下游引物P-28-R上添加了 Hind III酶切位点。扩增片段经克隆至PMD-19T载体序列测定后和pET-28a(+) —起进行双酶切。双酶切产物经回收、纯化后用T4DNA Iigase进行连接，16°C过夜。将连接产物转化感受态DH5 α后在含有50 μ g/mL卡那霉素平板上过夜培养。挑取单克隆在含有50 μ g/mL卡那霉素液体LB培养基摇培6h后提取质粒并进行双酶切鉴定和质粒PCR鉴定。经鉴定为阳性的菌株送上海博尚生物科技有限公司测序，经过测序验证正确的质粒命名为pET-TpgiP。
[0160]2)重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
[0161]将上述测序正确的重组质粒pET-Tpgipl μ g转化BL21 (DE3)感受态细胞，涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素平板上37°C过夜培养至单克隆出现。挑取单克隆于含有50 μ g/mL卡那霉素的液体LB培养基中培养8h。按照1:100的比例将培养液重新接种于含有50 μ g/mL卡那霉素的新鲜液体LB培养基中培养至0D6。。= 0.6-0.8后，加入IPTG至终浓度为1.0mM, 37°C继续培养 4h，分别在 2h，2.5h,3h, 3.5h, 4h 取样用于 SDS-PAGE 检测。SDS-PAGE电泳分析采用分子克隆常规方法进行，分离胶浓度12%，浓缩胶浓度为5%。对照分别采用转空白质粒菌株和转重组质粒未添加IPTG诱导菌株。
[0162]将阳性重组菌在ImM/L的IPTG37°C条件下培养6h取ImL菌液12000rpm下4°C离心5min收集菌体，加入裂解液(0.1M氯化钠，0.1mM Tris-Cl0.5mM PMSF，50 μ g/mL溶菌酶)后在冰浴条件下进行超声波破碎至菌液澄清。然后菌液在12000rpm下4°C离心5min收集上清和沉淀。分别向上清和沉淀中加入等体积5X上样缓冲液，沸水浴5min后取20 μ L样品上样进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白的可溶性。SDS-PAGE分析发现，阳性重组菌诱导不同时间后均表达出分子量为37KD的融合蛋白，且主要分布在上清液中。
[0163]3)重组蛋白的纯化和Western blotting检测
[0164]将阳性重组菌在IL的摇瓶中诱导培养后，12000rpm下4°C离心15min收集菌体，进行超声波破碎。破碎后的溶液12000rpm下4°C离心15min去除沉淀后留取上清。将上清液进行0.45 μ m滤膜过滤后用于上柱亲和层析。先用结合缓冲液上清液加入His Trap FF镍离子亲和层析柱进行室温静置2-3h，用结合缓冲液洗(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，20mM咪唑，pH7.4)平衡镍离子柱2次后，将上清上柱，室温孵育3h。然后分别用含有10mM咪唑、200mM咪唑和400mM咪唑的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH7.4)进行梯度洗脱。吸取20 μ L层析柱流出液进行12% SDS-PAGE电泳分析和Western blotting检测。
[0165]Western blotting检测采用以下步骤进行:将重组菌株诱导表达产物和初步纯化的重组蛋白同时在两块12% SDS-PAGE凝胶上进行电泳。一块凝胶电泳后直接染色并观察结果，另一块电泳后转NC膜进行Western blotting分析。转膜后的NC膜用含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液室温封闭l_2h，ant1-His 一抗用封闭液进行1000倍稀释后室温孵育2h，PBST缓冲液洗涤3次后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗(I: 250稀释)孵育2h，PBST洗涤5次后，用DAB试剂盒黑暗条件下充分显色，反应终止后拍片保存。
[0166]ffeatern blotting结果表明，重组菌表达的融合蛋白及进行亲和层析后的蛋白都可以特异性和ant1-His —抗发生特异性识别，充分表明构建的重组质粒pET-Tpgip可成功表达融合蛋白。
[0167]4) PGs-NtPGIP 活性测定
[0168]将辣椒疫霉菌接种于燕麦培养基上，28°C培养7天。从菌落边缘打1mm菌丝块，放入盛有100ml Czapek培养基的250ml三角瓶(每个菌丝块1ml培养基)。培养3_5天，培养物在12000rpm，4°C，离心30min，然后用Whatman GF/A过滤，用0.1M PH5.0乙酸钠透析浓缩即为粗PGs。
[0169]根据PGs降解多聚半乳糖醛酸生成还原性末端(醛基)及在单位时间内生成的还原性末端量与酶的催化反应速度成正比，采用3，5- 二硝基水杨酸试剂显色法测定生成还原性末端的数量，从而确定PGs活力和PGIP活力。首先制作D-半乳糖醛酸标准曲线，再按照0.5%多聚半乳糖醛酸溶液0.3ml,PGs0.1ml,0.05M PH5.0醋酸缓冲液适量、使NtPGIP纯化蛋白浓度为 0.0125 μ g/μ L,0.025 μ g/μ L,0.05μ g/μ L、0.1 μ g/μ L，总体积为 1ml，将反应液混匀，30°C孵育30min，加入DNSlml，沸水浴lOmin，冷却，重复三次，测OD575值。以加入灭活的PGs做阴性对照,灭活的NtPGIP蛋白作阳性对照。
[0170]结果显示，随着烟草NtPGIP蛋白浓度升高，PGs活性逐渐降低。
[0171]采用琼脂扩散法测定PGs-NtPGIP活性。首先倒琼脂板，用0.05M PH5.0醋酸缓冲液溶解0.5%多聚半乳糖醛酸和0.8%琼脂糖，每个板上打5个0.5cm圆孔。每孔加入60 μ L辣椒疫霉菌PGs浓缩液和适量的NtPGIP纯化蛋白和Tris-Cl (ΡΗ8.0)，使其浓度分别为 0.0125 μ g/μ L、0.025 μ g/μ L、0.05 μ g/ μ L、0.1 μ g/μ L,以加入 40 μ L 灭活的 NtPGIP蛋白为对照。30°C孵育12h后，用0.1%钌红溶液静置染色Ih左右，倒去表面残留的染色液，再用蒸馏水冲洗，观察透明圈的大小。根据透明圈的大小确定NtPGIP蛋白对辣椒疫霉菌PGs的抑制程度。
[0172]测定结果表明，烟草NtPGIP蛋白明显抑制了辣椒疫霉的PGs活性。
【主权项】
1.来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，其特征在于NtPGIP基因的DNA序列，如序列表SEQ ID NO:1所示。2.根据权利要求1所述的来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，其特征在于NtPGIP基因编码蛋白质的氨基酸序列，如序列表SEQ ID N0:2所示。
【专利摘要】本发明涉及来自烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因，属分子生物学应用技术领域，其特征在于烟草品种为小黄金，采用CTAB法提取其基因组DNA；按照Trizol试剂说明书提取其总RNA，利用M-MLV反转录酶合成cDNA；根据GenBank已报道植物的PGIPs基因设计简并引物，PCR扩增获得NtPGIP基因片段；然后采用3’RACE和5’RACE技术获得NtPGIP全长基因。本发明采用分子生物学方法，分离鉴定了烟草的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白NtPGIP基因；构建了烟草NtPGIP基因原核表达载体，并纯化了其表达蛋白；烟草NtPGIP基因表达蛋白能有效抑制病原菌分泌的PGs活性，抑制病菌的侵染，提高植物的抗病性，可应用于植物抗病品种的培育。
【IPC分类】C12N15/29, C07K14/415
【公开号】CN105200062
【申请号】CN201410285635
【发明人】孙文秀, 李伟, 张成省
【申请人】长江大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年6月23日