一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用snp标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖分子标记技术领域，具体设及一种皱纹盘鲍中国和日本群体 鉴别用SNP标记。
【背景技术】
[0002] 皱纹盘鲍化aliotisdis州Shannai)隶属于软体动物口，腹足纲，分布于我国迂 宁、山东半岛，日本东北部等地区，是我国北方重要的养殖经济贝类。90年代中后期，为减少 种质衰退带来的养殖皱纹盘鲍产量和成活率降低等问题，我国开始从日本引进皱纹盘鲍， 将其与本地群体杂交生产杂交鲍。中日群体杂交产生的杂交鲍有明显的杂交优势，已被广 泛应用于养殖生产。但在杂交种培育过程中，对高价购买的日本群体难W在形态上与中国 群体进行区分，因此开发能够鉴别两群体的分子标记对确定杂交种培育的亲本来源至关重 要，但目前尚未有相关报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用SNP标记，即一种区分 皱纹盘鲍中国和日本群体的SNP位点，W及检测该位点的分型用的引物和探针，从而弥补 现有技术的不足。
[0004] 本发明首先提供SNP位点，其中位点化lhSNP30_CT是序列为SEQIDNO: 1的第99 位，其碱基为C/T;位点化lhSNP32_CT是序列为SEQIDNO:2的第138位，其碱基为C/T;位 点H化SNP36_CA是序列为SEQIDNO: 3的第107位，其碱基为C/A;位点化lhSNP41_CT是序 列为SEQIDN0:4的第106位，其碱基为C/T;位点化lhSNP44_AG是序列为SEQIDN0:5的 第54位，其碱基为A/G。 阳〇化]本发明另一个方面提供用于检测上述SNP位点的引物组和探针；具体如下：
[0006] 检测位点化lhSNP30_CT的引物组的上下游引物的序列为沈QIDN0:6和沈QID N0:7,探针的序列为沈QIDN0:8;
[0007] 检测位点化lhSNP32_CT的引物组的上下游引物的序列为沈QIDN0:9和沈QID NO: 10,探针的序列为沈QIDNO: 11 ; 阳00引检测位点化lhSNP36_CA的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO: 12和SEQID NO: 13,探针的序列为沈QIDNO: 14;
[0009] 检测位点化lhSNP41_CT的引物组的上下游引物的序列为沈QIDNO: 15和沈QID NO: 16,探针的序列为沈QIDNO: 17 ;
[0010] 检测位点化lhSNP44_AG的引物组的上下游引物的序列为沈QIDNO: 18和沈QID NO: 19,探针的序列为沈QIDNO:20; W11] 上述SNP位点的引物组和探针用于皱纹盘鲍中国和日本群体的鉴别；
[0012] 本发明再一个方面提供一种鉴别皱纹盘鲍中国和日本群体的方法，包括如下的步 骤：
[001引 1)基因组DM的提取：提取待检测的皱纹盘鲍各群体中不少于30个个体的基因 组DNA;同时提取作为检测参考群体的中国群体的不少于30个个体的基因组DNA;
[0014] 2)SNP位点分型：采用上述的引物组对群体中每个取样个体的基因组DNA分别进 行PCR扩增，然后向PCR产物中加入探针，95°C变性lOmin;再利用高分辨率溶解曲线化i曲 ResolutionMelting,HRM)对变性产物进行分型检测，W0.rC/s的速率从40°C升溫至 95 °C，分析扩增产物的溶解曲线，记录个体的基因型；
[0015] 3)SNP位点等位基因频率差异分析：统计SNP位点在待检测群体中的等位基因频 率，利用化i-squared检验，分析待检测群体与参考群体的等位基因频率的差异；若检测结 果符合W下差异分布情况，则确定待测群体为日本群体，具体如下：
[0016] 位点化lhSNP30_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05);
[0017] 位点化lhSNP32_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05);
[0018] 位点化lhSNP36_CA中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05);
[0019] 位点化lhSNP41_CT中，等位基因C的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05);
[0020] 位点化lhSNP44_AG中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05)。
[0021] 本发明操作简单、费用低、精确度高。使用本发明的SNP标记对皱纹盘鲍中国和日 本群体进行鉴定，将使群体水平的育种亲本鉴别更加简便易行。
【具体实施方式】
[0022] 单核巧酸多态性（singlenucleotidepolymo巧hisms，SNP)标记具有基因组分布 广泛，遗传稳定性高的优点，是群体遗传研究的有力分子工具。本发明在前期比较皱纹盘鲍 中国群体和日本群体的基因组序列的基础上，筛查到在两群体间基因频率差异显著的SNP 位点，进一步开发成标记，用于在群体水平对中国和日本皱纹盘鲍进行鉴别。
[0023] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。 阳〇24] 实施例1 阳0巧]利用二代测序技术分别对皱纹盘鲍5个中国个体和5个日本个体进行高通量测 序，利用所有个体测序reads构建皱纹盘鲍基因组scafTold，作为后续分析的参考基因组 序列。分别将中国个体和日本个体的测序reads向参考基因组上比对，筛查SNP位点并计 算其在中国和日本群体中的等位基因频率，利用化i-squared检验计算两个群体的等位基 因频率的差异，筛选差异显著的SNP位点。共筛选出5个SNP位点，其中位点H化SNP30_CT 是序列为SEQIDN0:1的第99位，其碱基为C/T;位点化lhSNP32_CT是序列为SEQIDN0:2 的第138化其碱基为C/T;位点H化SNP36_CA是序列为SEQIDNO: 3的第107化其碱基为 C/A;位点化lhSNP41_CT是序列为沈QIDN0:4的第106位，其碱基为C/T;位点化lhSNP44_ AG是序列为SEQIDNO: 5的第54位，其碱基为A/G。
[0026] 根据SNP位点附近的基因组序列，设计HRM分型用引物和探针。标准如下：a)探 针长度为25-4化p;只包含1个候选位点，位点居于探针中间，不含缺失位点，3'端加2个 错配碱基；退火溫度为58°C-60°C;不含简单重复序列及回文序列。b)引物长度19-2化P; 引物序列中不包含候选位点及缺失位点；扩增产物长度70-130bp;GC含量30% -70%。 [0027] 检测位点化lhSNP30_CT的引物组的上下游引物的序列为沈QIDN0:6和沈QID N0:7,探针的序列为沈QIDN0:8; 阳02引检测位点化lhSNP32_CT的引物组的上下游引物的序列为沈QIDN0:9和沈QID NO: 10,探针的序列为沈QIDNO: 11 ;
[0029] 检测位点化lhSNP36_CA的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO: 12和SEQID NO: 13,探针的序列为沈QIDNO: 14;
[0030] 检测位点化lhSNP41_CT的引物组的上下游引物的序列为沈QIDNO: 15和沈QID NO: 16,探针的序列为沈QIDNO: 17; 阳03U检测位点化lhSNP44_AG的引物组的上下游引物的序列为沈QIDNO: 18和沈QID NO: 19,探针的序列为沈QIDNO:20。 阳0巧 实施例2
[0033] 本实施例为利用上述的SNP位点的引物组和探针对鉴别皱纹盘鲍中国和日本群 体的验证，包括如下的步骤：
[0034] 1)皱纹盘鲍基因组DNA提取：取足肌肉约0.Ig，加入500y1STE裂解缓冲液，剪 碎，依次加入50y1 10%SDS、5y1蛋白酶K(20mg/ml)，56°C裂解约化，至裂解液澄清。加 入同体积Tris饱和酪（250 ^1)，氯仿/异戊醇（24:1) (250 ^1)，轻轻晃动20min，12000巧m 离屯、l