Omin。取上清，重复上述步骤，直至水相与有机相之间无蛋白质层。取上清，加入同 体积氯仿/异戊醇（24:1)，轻晃20min，12000巧m离屯、lOmin。取上清，加入1/10体积3M NaAc(抑5. 2)和2倍体积冷无水乙醇，摇匀后-20°C静置20min，1250化pm离屯、20min。将核 酸沉淀于管底。弃上清，70%乙醇洗涂沉淀。收集沉淀，空气中干燥至乙醇全部挥发。加入 20y1TE(含RNaseA)溶解DNA并消化RNA，37°C静置约30min后，4°C保存。1 %琼脂糖凝胶 电泳检测DNA样品，紫外分光光度计检测浓度及纯度。
[0035] 2)SNP位点分型：W皱纹盘鲍中国和日本两个群体的各30个个体的基因组DNA为 模板，利用引物进行PCR扩增，反应体系如下：10XBufferlyl，2. 5mMdNTP0. 8yl，2. 5mM MgClzO. 6yl，正向引物（lOyM)O.lyl，反向引物（lOyM)O. 5yl，Taq酶巧U/iU)0.lyl， 模板0. 5y1，LCGreen饱和巧光染料0. 7y1，加&0补足至10y1。扩增反应在Biometra 1'-6阿山6111?0?系统上完成，反应条件如下：941：4111111;941：4〇3,631：4〇3,60次循环； 72°C5min。向每份PCR产物中加入3yl对应探针（l〇yM)，95°C变性lOmin。取lOyl 变性产物转入96孔BLK/WHT板中度io-Rad)，加入15y1矿物油，2000巧m离屯、Imin。在 Li曲t-Scanner中进行分型检测，W0.rC/s的速率从40°C升溫至95°C，持续采集巧光信 号。用Li曲tScannerCallITv2. 0软件分析溶解曲线，记录个体的基因型：烙解曲线单峰 溫度高者为与探针序列相同纯合型，单峰溫度低者为突变纯合型，双峰者为杂合型。
[0036] 3)皱纹盘鲍中国和日本群体等位基因频率差异性分析：统计SNP位点分别在两个 群体中的等位基因频率，利用化i-squared检验，分析两个群体的SNP位点等位基因频率的 差异。结果如下：
[0037] 位点化lhSNP30_CT中，等位基因T的频率在日本群体（0. 375)中显著低于中国群 体 〇). 815) (p-value= 5. 60E-06);
[0038] 位点化lhSNP32_CT中，等位基因T的频率在日本群体化500)中显著低于中国群 体 〇). 768) (P-value= 0. 004);
[0039] 位点化lhSNP36_CA中，等位基因A的频率在日本群体（0. 479)中显著低于中国群 体 〇). 839) (P-value= 9. 50E-05); W40] 位点化lhSNP41_CT中，等位基因C的频率在日本群体化167)中显著低于中国群 体 〇). 625) (P-value= 2. 23E-06); 阳〇W 位点化lhSNP44_AG中，等位基因A的频率在日本群体化208)中显著低于中国群 体 〇). 571) (P-value= 1. 68E-04)。
[0042] 上述引物和探针在杂交鲍培育中用于日本皱纹盘鲍亲本群体的检测，优先选择5 个位点的等位基因频率与中国群体均差异显著的群体作为亲本，提高育种效率。
[0043] 本发明中公开的皱纹盘鲍中国和日本群体差异SNP标记和其引物组及探针，具有 稳定遗传、操作简便、鉴定快速、结果直观、经济实用等优点，能有效地对皱纹盘鲍中国和日 本地理群体进行区分鉴定。在实际杂交育种过程中，对已知的中国群体（参考群体）和与 其杂交的待测群体进行SNP位点分型，计算等位基因频率，利用化i-squared检验，检测上 述SNP位点在参考群体和待测群体中的基因频率差异，可W确定待测群体是中国群体还是 日本群体，利用验证的日本群体与已知的中国群体进行杂交育种工作，可加快育种进程，避 免不必要的经济损失。
【主权项】
1. 一种SNP位点，其特征在于，所述的SNP位点，其中位点HdhSNP30_CT是序列为SEQ IDNO: 1的第99位，其碱基为C/T;位点HdhSNP32_CT是序列为SEQIDNO:2的第138位， 其碱基为C/T;位点HdhSNP36_CA是序列为SEQIDNO:3的第107位，其碱基为C/A;位点 HdhSNP41_CT是序列为SEQIDN0:4的第106位，其碱基为C/T;位点HdhSNP44_AG是序列 为SEQIDNO: 5的第54位，其碱基为A/G。2. 权利要求1所述的SNP位点在制备鉴别皱纹盘鲍中国群体和日本群体的分子标记中 的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的分子标记为引物和探针。4. 一种引物组和探针，其特征在于，所述的引物组用于检测权利要求1所述的SNP位 点。5. 如权利要求4所述的引物组和探针，其中检测位点HdhSNP30_CT的引物组的上下游 引物的序列为SEQIDN0:6和SEQIDN0:7,探针的序列为SEQIDN0:8; 检测位点HdhSNP32_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDN0:9和SEQIDN0:10， 探针的序列为SEQIDNO: 11 ; 检测位点HdhSNP36_CA的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO: 12和SEQID NO: 13,探针的序列为SEQIDNO: 14; 检测位点HdhSNP41_CT的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO: 15和SEQID NO: 16,探针的序列为SEQIDNO: 17; 检测位点HdhSNP44_AG的引物组的上下游引物的序列为SEQIDNO: 18和SEQID NO: 19,探针的序列为SEQIDNO:20。6. 权利要求5所述的引物组和探针在鉴别皱纹盘鲍中国群体和日本群体中的应用。7. -种鉴别皱纹盘鲍中国和日本群体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步 骤： 1) 基因组DNA的提取：提取待检测的皱纹盘鲍的个体的基因组DNA;同时提取作为检 测参考群体的中国群体的个体的基因组DNA; 2)SNP位点分型：采用权利要求5所述的引物组对待检测的群体中每个取样个体的 基因组DNA分别进行PCR扩增，然后向PCR产物中加入权利要求5所述的探针，95 °C变性 IOmin;再利用高分辨率溶解曲线对变性产物进行分型检测，以0. 1°C/s的速率从40°C升温 至95 °C，分析扩增产物的溶解曲线，记录个体的基因型； 3. SNP位点等位基因频率差异分析：统计SNP位点在待检测群体中的等位基因频率，利 用Chi-squared检验，分析待检测群体与参考群体的等位基因频率的差异；若检测结果符 合以下差异分布情况，则确定待测群体为日本群体，具体如下： 位点HdhSNP30_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05)； 位点HdhSNP32_CT中，等位基因T的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05)； 位点HdhSNP36_CA中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05)； 位点HdhSNP41_CT中，等位基因C的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P<0. 05)； 位点HdhSNP44_AG中，等位基因A的频率在待测群体中显著低于中国参考群体 (P〈0. 05) 〇8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中个体的数目不少于30个。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种皱纹盘鲍中国和日本群体鉴别用SNP标记，一种区分皱纹盘鲍中国和日本群体的SNP位点。本发明另一个方面还提供用于检测上述SNP位点的引物组和探针。使用本发明的SNP标记对皱纹盘鲍中国和日本群体进行鉴定，将使群体水平的育种亲本鉴别更加简便易行。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105200051
【申请号】CN201510719444
【发明人】胡晓丽, 包振民, 于茜, 李仰平, 王师, 张玲玲, 陆维
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月29日