] l'ubian-Te-MTT2-R-2 :CAAGGGTTGCATTGGCAATTTTCAG
[0036] 上述引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
[0037]利用Te-MTT2-F/Te-MTT2-R，通过PCR技术从四膜虫Tetr址ymenaelliotti 中扩增获得新基因，核巧酸序列为SEQIDNO: 1。利用l\ibian-Te-MTT2-F-l/ l\ibian-Te-MTT2-R-l，和l\ibian-Te-MTT2-F-2/Tubian-Te-MTT2-R-2,通过PCR方法突变基 因序列中的两个大肠杆菌终止密码子灯AA)获得突变基因Te-MTT2,核巧酸序列为SEQID NO: 2。回收PCR产物并将其与中间载体pMD-lST按照合适比例混合，16°C过夜连接，连接产 物转化大肠杆菌D册a大量扩增，提取质粒pMD-18T-Te-MTT2并进行PCR和酶切鉴定。
[0038] 分别对pMD-18T-Te-MTT2和表达pSUMO进行BamHI酶切和化0I酶切，酶切产物 回收，用酶切后的Te-MTT2和载体pSUMO,按比例混合，用T4连接酶16°C过夜连接，连接产 物pSUM0-Te-MTT2转化大肠杆菌D册a，卡那霉素的LB固体培养基平板，37°C过夜培养，挑 取单菌落在LB液体培养基中大量培养，纯化质粒通过PCR和BamHI和化0I酶切鉴定（图 1)，Mr为Trans2KPlusIIDNAMarker,Te-MTT2 的全长为 273bp，pSUM0-Te-MTT2 酶切后的 片段分别为5628bp和273bp。重组质粒pSUM0-Te-MTT2的示意图（图2)。
[0039] 实施例2金属硫蛋白基因Te-MTT2的体外表达和鉴定
[0040] 将重组质粒pSUM0-Te-MTT2转入大肠杆菌化21，挑取单菌落在LB液体培养基中培 养至对数生长期，用IPTG诱导后继续培养地，100化pm，4°C离屯、5min收集细胞，将细胞重悬 于PBS缓冲液中，超声波细胞破碎仪超声破碎菌体，收集全菌液及上清液，将表达产物进行 12%SDS-PA(iE分析，未用IPTG诱导的大肠杆菌细胞株表达的蛋白做对照。表达出目的蛋 白SUM0-Te-MTT2预测其大小为30邸，结果可初步确定SUM0-Te-MTT2表达成功（图3)。
[0041] 重组蛋白SUM0-Te-MTT2 的Westernblotting检巧U。将BL21/pSUM0 和 BL21/pSUM0-Te-MTT2的全菌和上清分别进行12 %SDS-PAGE;转膜；封闭；加一抗 Anti-His(1:5000)进行抗原抗体反应；二抗IgG(1:15000)解育；LI-C0RDdyss巧红外巧光 扫描成像。Westernblotting结果显示，BL21/pSUM0-Te-MTT2全菌和上清蛋白在30邸处出 现条带，对照化21/pSUMO全菌和上清蛋白在20KD处出现条带，表明重组蛋白SUM0-Te-MTT2 在大肠杆菌中表达成功（图4)。
[0042] 实施例3大肠杆菌化21/pSUMO和大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2对C(T的耐受 性分析
[0043] 分别将大肠杆菌化21/pSUMO和大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2转至含有100yg/ 血卡那霉素的LB培养基巧血）中培养至0D600 = 0. 7时，加入IPTG至终浓度为0. 05mM， 继续培养地，分别诱导SUMO标签蛋白和SUM0-Te-MTT2蛋白的表达。分别将两种细胞株转 至多管LB培养基巧血）中，使其终浓度均为0D600 = 0. 1，同时向接种有运两种菌株的多管 培养基中分别加入浓度梯度的CcT，继续培养化，检测细菌增值。
[0044] 数据处理：检测样品每组设置S个平行，绘制菌浓度一检测样品CcT浓度关系图 (图 5)。
[0045] 实施例4大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2富集水体重金属
[0046] 分别将大肠杆菌化21/pSUMO和大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2转至含有100yg/ 血卡那霉素的LB培养基（100血）中，37°C，180转培养至0D600 = 0. 7时，加入IPTG至终 浓度为0. 〇5mM，继续培养地，分别诱导SUMO标签蛋白和SUM0-Te-MTT2蛋白的表达。菌株 培养液中都加入80ug/ml的CcT，继续培养化后无菌条件下取出50mL培养中的培养液， 1300化pm离屯、，取上清备用；剩下的50mL培养液继续培养至17h，相同条件取上清样备用， 用X射线巧光光谱仪检测大肠杆菌化21/pSUMO和大肠杆菌化21/pSUM0-Te-MTT2经IPTG 诱导后馨合CcT的能力。
[0047] 数据处理：受试样品S次重复，菌体馨合CcT能力一受试样品反应时间关系图（图 6) 〇
【主权项】
1. 一种金属硫蛋白基因，其核苷酸序列为SEQIDNO: 1。2. -种金属硫蛋白突变基因Te-MTT2,其核苷酸序列为SEQIDNO: 2。3. 如权利要求2所述的突变基因编码的多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:3。4. 一种重组质粒pSUM0-Te-MTT2,含有权利要求2所述的突变基因。5. -种重组基因工程菌，是将权利要求4所述的重组质粒pSUM0-Te-MTT2转化到大肠 杆菌BL21得到的重组基因工程菌BL21/pSUM0-Te-MTT2。6. 如权利要求5所述的重组基因工程菌BL21/pSUM0-Te-MTT2在处理重金属污水中的 应用。7. 如权利要求6所述的应用，所述重金属为镉、銅、铅或汞。8. 如权利要求2所述突变基因Te-MTT2在重金属污染修复中的应用。9. 如权利要求3所述的多肽在重金属污染修复中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种新的金属硫蛋白基因及其应用。本发明通过PCR技术从四膜虫Tetrahymena？elliotti中扩增获得一种新基因，突变终止密码子之后获得突变基因Te-MTT2，突变基因Te-MTT2连接到载体pSUMO中，获得含有该基因的重组质粒pSUMO-Te-MTT2，转化大肠杆菌BL21后，经IPTG诱导，重组基因工程菌BL21/pSUMO-Te-MTT2表达出可溶性蛋白SUMO-Te-MTT2。重组基因工程菌BL21/pSUMO-Te-MTT2在IPTG诱导下有很强的重金属胁迫耐受力和富集金属离子的能力，重组基因工程菌BL21/pSUMO-Te-MTT2在治理水环境重金属污染方面有广泛的应用前景。
【IPC分类】C07K14/825, C12R1/19, C12N15/30, C02F101/20, C02F3/34, C12N1/21, C12N15/70
【公开号】CN105200065
【申请号】CN201510762680
【发明人】王伟, 郭荣, 许静, 梁爱华
【申请人】山西大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月10日