in。
[0026] 酶活测定方法：1血反应体系中含有200yL发酵液细胞，800yL pH 7.0憐酸盐缓 冲溶液Ig/L底物，30°C条件下，反应30min，终止反应。酶活力定义为：
[0027]HPLC分析：正相HPLC分析丫 -内酷胺底物选择性和转化率，色谱柱为化icel 化^曰19曰〇4 45-扎流动相为乙腊与异丙醇（比例为8:2)，流速为0.3血/111111，波长为230皿。
[0028]HPLC化学纯度分析：产品纯度检测：色谱柱为DiamonsilC18(2) ,250X4. 6mm，流 动相为甲醇与水（比例为9:1)，流速为ImL/min，紫外检测波长为225nm。
[0029]实施例 1 :重组Bacillussubtilis168/pMA5-delm菌株构建
[0030]WDelftiasp.CGMCC5755基因组为模板，W化rward和Reverse为上下游引物 扩增获得目的基因片段（约1230bp)，命名为delm。将PCR产物纯化后，经Ndel和BamHI 双酶切，回收，与经过相同限制性内切酶线性化处理的载体pM5连接，连接后转入大肠杆 菌E.coliJM109,涂布氨节青霉素抗性平板，验证阳性克隆子。对连接成功的重组质粒 pMA5-delm重新转化Bacillussubtilis168感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板。验证转 化成功的重组菌株Bacillussubtilis168/pMA5-delm。
[0031] 实施例2 :重组枯草芽抱杆菌的发酵产酶
[0032]W过夜培养的重组Bacillussubtilis168/pMA5-delm为种子液，按照2~5%的 接种量转接至发酵培养基，37°C培养，揽拌转速300~70化pm，控制溶氧最低为15%，pH维 持7. 0左右。发酵12h，WeOOOXg常溫离屯、收集菌体，W0. 〇2mol/L的憐酸盐（pH7. 0)缓 冲溶液洗涂细胞，冻干低溫保存。
[0033] 实施例3 :重组枯草芽抱杆菌的固定化
[0034] 将Ig冻干细胞充分溶解于lOmL去离子水中，与3%的海藻酸钢溶液40mL混合揽 拌，通过注射器枕头将上述混合液W5cm高度注入1%的氯化巧溶液中立即形成光滑的微 球体，并将此固定化小球保持在4°C的上述氯化巧溶液中硬化30min，进而在0. 3 %的戊二 醒溶液中进一步硬化，用生理盐水洗涂后将固定化细胞储存在4°C冰箱中备用。经测定，所 得固定化细胞的活力回收率为48%。
[0035] 实施例4 :重组枯草芽抱杆菌不对称水解r-内酷胺条件优化
[0036] (1)全细胞转化的最适溫度：lmL反应体系中，含有终浓度为Ig/L重组枯草芽 抱杆菌冻干细胞的憐酸盐缓冲溶液（pH7.0,0.Imol/L)，分别于10、20、30、40、50、60、70、 80°C溫度下预热lOmin，加入底物丫-内酷胺至终浓度为5g/L继续于上述溫度下震荡反应 30min，加热终止反应，HPLC检测底物的转化率。结果如表1所示，综合溫度稳定性，确定最 适转化溫度30°C。
[0037]表1反应溫度对重组枯草芽抱杆菌整细胞水解拆分丫 -内酷胺的影响
[0038]
[0039]
[0040] (2)全细胞转化的最适抑：1血反应体系中，含有终浓度为Ig/L的重组枯草 芽抱杆菌冻干细胞的0.Imol/L不同抑值的缓冲溶液（pH6. 0 - 8. 0憐酸盐缓冲液，pH 9. 0-11.OTris-HCl缓冲液），30°C溫浴lOmin，加入终浓度为5g/L的底物丫-内酷胺，于最 适溫度下，转化反应化，终止反应，HPLC检测底物的变化。最适转化抑为9. 0。
[0041] 表2缓冲液抑对重组枯草芽抱杆菌整细胞水解拆分丫 -内酷胺的影响
[0042]
[0043] (3)最适揽拌转速：50mL反应体系中含有lOg/L冻干细胞，底物浓度为50g/L，在 上述优化的最适溫度和抑条件下，考察揽拌转速对水解反应的影响，转速设定为200, 300 和40化/min。每隔一段时间取样，进行HPLC分析。经确定，最适揽拌转速为30化/min。
[0044] 表3揽拌转速对重组枯草芽抱杆菌整细胞水解拆分丫 -内酷胺的影响
[0045]
[0046] 实施例5 :利用重组枯草芽抱杆菌游离整细胞制备光学纯（-)-丫-内酷胺
[0047] 应用上述优选条件（pH9. 0,30°C，300;r/min)，在500血转化体系中，分别利用 lOg/L和15g/L重组枯草芽抱杆菌冻干细胞，对lOOg/L丫-内酷胺进行拆分水解W制备光 学纯（-)-丫-内酷胺。最终，lOg/L催化剂添加条件下，反应化，转化率为55. 2%和ee为 98. 6% ;15g/L催化剂添加条件下，反应地，转化率为56. 3%的和ee为99. 2%。
[0048] 表4利用重组枯草芽抱杆菌游离整细胞放大制备光学纯（-)-丫-内酷胺
[0049]
[0050]实施例6 :利用重组枯草芽抱杆菌固定化细胞制备光学纯（-)-丫-内酷胺 [005。 应用上述优选条件（pH9. 0,30°(：，300以111111)，在500血转化体系中，分别利用 lOg/L和15g/L重组枯草芽抱杆菌固定化细胞，对lOOg/L丫-内酷胺进行拆分水解W制备光 学纯（-)-丫-内酷胺。最终，在lOg/L催化剂添加条件下，反应12h，转化率为54. 5%和ee 为98. 7% ;在15g/L催化剂添加条件下，反应lOh，转化率为55. 6%和ee为99. 0%。
[0052] 表4利用重组枯草芽抱杆菌游离整细胞放大制备光学纯（-)-丫-内酷胺
[0053]
[0054] 实施例7 : -丫-内酷胺产品分离提取
[0055] 对上述转化反应，利用等体积的二氯甲烧萃取反应液=次，合并有机相，W无水硫 酸钢干燥后，减压蒸馈、干燥，得到产品（-)-丫-内酷胺。经检测，（-)-丫-内酷胺的光学纯 度大于99 %，化学纯度大于98 %。
【主权项】
1. 一重组表达载体，其特征是：所述重组表达载体的骨架为PMA5,其包含有来源于 Delftiasp.CGMCC5755来源的（+)-y-内酰胺酶基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo. 1 所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQIDNo. 2所示。2. -种重组表达转化体，其特征在于：其包含如权利要求1所述的重组表达载体或内 酰胺酶基因。3. 如权利要求2所述的重组表达转化体，其特征在于：其为将权利要求1所述的重组 表达载体转化至宿主微生物中制得的基因工程菌；所述的表达宿主为枯草芽孢杆菌，较佳 的为枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis) 168。4. 一种重组（+)-y-内酰胺酶的制备方法，其特征在于包含如权利要求3所述的重组 表达转化体，获得重组（+)-T-内酰胺酶。5. 如权利要求4所述的重组（+)-y-内酰胺酶的制备方法，其特征在于其包括如下 步骤：将如权利要求3所述的重组表达转化体接种至培养基中过夜培养获得种子液，将种 子液按2~5%的接种量将种子液转接至3L发酵罐中培养，过程中控制溶氧不低于15%， pH在7.0左右，37°C培养12h后收集细胞，并冷冻干燥获得重组（+)-y-内酰胺酶；所述 的培养基包括：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物16g/L，葡萄糖4g/L，NaC15g/L，Na2HP044g/L， KH2PO4O. 5g/L，（NH4)2S043g/L，pH为 7. 0〇6. -种产（+) _y-内酰胺酶重组枯草芽孢杆菌的固定化方法，其特征在于将权利要求 5所述的重组转化体进行包埋固定化，获得固定化催化剂。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于其包含如下步骤：将Ig冻干细胞充分溶 解于IOmL去离子水中，与40mL3%的海藻酸钠溶液混合搅拌，通过注射器针头将上述混合 液以5cm高度注入1 %的氯化钙溶液中立即形成光滑的微球体，并将此固定化小球保持在 4°C的上述氯化钙溶液中硬化30min，进而在0. 3 %的戊二醛溶液中进一步硬化，用生理盐 水洗涤后将固定化细胞储存在4°C冰箱中备用。8. 如权利要求5或7所述的固定化细胞作为催化剂在对映选择性拆分Y-内酰胺以制 备光学活性Y-内酰胺中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：利用如权利要求5所述重组枯草芽孢杆菌 冻干细胞10~15g/L，催化水解100g/Ly-内酰胺底物，反应条件为温度30°C;pH8~10， 优选pH9. 0 ;搅拌转速200~400rpm，优选400rpm。反应结束后，经过二氯甲烷萃取、减压 蒸馏和干燥处理，最终获得纯度大于99%的（-)-y-内酰胺。10. 如权利要求8所述的应用，其特征在于：利用如权利要求7所述的重组枯草芽孢 杆菌固定化细胞10~15g/L，水解100g/Ly-内酰胺底物，反应条件为温度30°C，pH9. 0， 搅拌转速300rpm，反应结束后分离细胞，重新加入100g/LY-内酰胺底物继续反应，连续操 作5批后合并反应液，经过二氯甲烷萃取、减压蒸馏和干燥处理，最终获得纯度大于99%的 ㈠-丫-内酰胺。
【专利摘要】本发明公开了一种应用重组枯草芽孢杆菌全细胞催化生产光学纯(-)-γ-内酰胺的方法，属于基因工程和生物工程领域。本发明通过构建含有来源于Delftia？sp.CGMCC？5755的(+)-γ-内酰胺酶基因的重组枯草芽孢杆菌B.subtilis？168/pMA5-delm，并表达产酶制备全细胞催化剂，对该重组全细胞进行固定化，应用该重组枯草芽孢杆菌到对映选择性水解外消旋γ-内酰胺，最终获得光学纯度大于99％的(-)-γ-内酰胺。该微生物催化制备(-)-γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率和高产物浓度的特点。CGMCC 575520120214
【IPC分类】C12P41/00, C12N11/10, C12N9/86, C12N11/04, C12N1/21, C12N15/75, C12R1/125
【公开号】CN105200076
【申请号】CN201510612331
【发明人】倪晔, 韩瑞枝, 许国超, 董晋军, 薛天云
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月23日