用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体而言，设及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应 工程菌的构建与使用方法。
【背景技术】
[0002] 茶氨酸化-Theanine)是茶叶中特有的游离氨基酸，属于酷胺类化合物，学名为 N-乙基-丫-k谷氨酷胺巧-N-eth^-丫-kglutamine)。茶氨酸在化学构造上与脑内活性 物质谷酷胺、谷氨酸相似，是茶叶中生津润甜的主要成份。
[0003] 茶氨酸主要应用于医药和食品领域。在医药方面，茶氨酸具有降血压的作用；与抗 癌药物共同使用，可W增强抗肿瘤药物的疗效；具有松弛神经紧张和焦虑的作用；能引起 脑内神经递质的变化，促进大脑的学习和记忆功能，并且能对帕金森症、传导神经功能素乱 等疾病起到预防效果；具有改善经期综合征和减肥的作用；另外，茶氨酸有抗疲劳、提高免 疫力和防御病毒的作用。在食品方面，茶氨酸作为茶饮料的品质改良剂、改善食品风味的添 加剂和功能食品的添加剂。另外，茶氨酸还应用于化妆品中作为保湿剂和皮肤保湿食品等。
[0004] 目前，茶氨酸的合成方法主要有化学合成法和生物转化合成法。化学合成法反应 过程复杂，副产物多，提取困难，收率较低，安全性差，能耗高且污染大，不适合工业化生产。 生物转化合成法又可W分为茶树愈伤组织培养法、酶转化法合成和微生物转化法。其中，茶 树愈伤组织培养法茶氨酸生产量低，产品分离纯化过程复杂及生产工艺的控制难度大，运 种植物组织细胞培养法本身也还只在试验研究阶段。酶转化法合成是从微生物中提取酶， 用酶提取液作为催化剂，催化底物一步转化生成茶氨酸，此法可W实现酶与底物充分接触， 转化周期短，但酶极其不稳定，无法制成纯品再加入到合成反应器中，且无法回收利用。
[0005] 微生物转化法是用完整的微生物细胞将底物一步转化为茶氨酸，此法的实质和酶 转化法合成一样是利用微生物体内的裂和酶或转胺酶来进行转化底物，微生物发酵法生产 的茶氨酸具有成本低、容易从反应液中提取获得产物、转化效率高、可大量生产的特点，因 此，采用微生物发酵是实现茶氨酸规模化生产的必由之路。
[0006] 近年来，有学者筛选高活性产茶氨酸的微生物菌株进行生产茶氨酸，但由于酶活 较低，茶氨酸的产量很低。此外，很多用于构建基因工程菌的质粒还存在表达效率低、不够 稳定的缺点。同时，也有学者利用基因工程技术构建表达关键酶的重组菌通过微生物转化 法生产茶氨酸，但大多数克隆的是T-谷氨酷基转肤酶，催化的底物是谷氨酷胺和乙胺，底 物成本较高，不利于工业化生产。
[0007] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一目的在于提供一种丫 -谷氨酷甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所 述的质粒在大肠杆菌中表达效率高，其中的丫-谷氨酷甲胺合成酶基因表达出的丫-谷氨 酷甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催 化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。
[0009] 本发明的第二目的在于提供一种丫-谷氨酷甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的 构建方法，该构建方法可对T-谷氨酷甲胺合成酶的原始序列进行优化，可解决现有技术 所用质粒表达效率低的问题。
[0010] 本发明的第=目的在于提供茶氨酸基因工程菌，该基因工程菌由丫-谷氨酷甲胺 合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，且该基因工程菌易于培养，可解 决现有菌株不够稳定的缺点。
[0011] 本发明的第四目的在于提供一种茶氨酸基因工程菌用于生产心茶氨酸的方法， 该方法简单易行。
[0012] 为了实现本发明的上述目的，特采用W下技术方案：
[0013] 一种丫-谷氨酷甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述表达质粒上的所述丫-谷 氨酷甲胺合成酶的碱基序列为SEQIDNO: 1所示。
[0014] 本申请所采用的丫-谷氨酷甲胺合成酶为对Meth^ovorusmaysNO. 9来源的 GenBankAccession号为AB333782.1的丫-谷氨酷甲胺合成酶基因原始序列进行优化得 来，该酶可将谷氨酸和乙胺催化生成k茶氨酸，催化效率高，且底物性价比高，可有效降低 成本。
[0015] 一种如上所述的丫-谷氨酷甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，包括W 下步骤：
[001引 1)、针对大肠杆菌表达系统对Meth}dovo;rusmaysNO. 9来源的GenBank Accession号为AB333782. 1的丫-谷氨酷甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列 中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强 终止子，在原序列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列；
[0017]2)、W优化的卵as基因序列为模板，合成碱基序列为SEQIDNO: 1所示的卵as基 因片段；
[0018]3)、将所述优化的gmas基因片段连接到原核表达载体上，得到丫-谷氨酷甲胺合 成酶的大肠杆菌表达质粒。
[0019] 密码子总计有64种，但实际最终对应翻译的目的氨基酸种类只有20种，运就意味 着，存在某些多个密码子编码同一种氨基酸的现象，也称做密码子的简并性。正是由于该特 性，每个氨基酸至少对应1种密码子，最多可W有一种氨基酸对应6种密码子。但运些编码 相同氨基酸的不同密码子，在不同物种、不同生物体中使用的频率并非完全地平均分布，也 即绝大多数生物倾向于只利用运些密码子中的一部分，该现象也称密码子的偏好性。其中 那些被最频繁利用的密码子称为高频密码子，而那些不被经常利用的密码子称为低频密码 子。为了能让Meth^ovorusmaysNO. 9来源的基因在大肠杆菌表达系统中高效表达，本申 请对其原始密码子进行了优化，将原始序列中的低频密码子转换为同义的大肠杆菌高频密 码子。
[0020] 针对原基因中终止子终止翻译效率不高的特点，本申请优选将其密码子替换为 TAAT强终止子，使用强终止子可W使核糖体在翻译完成后更快更有效地从模板上脱离，一 方面可进一步提高转录效率，另一方面也可W避免无功能的过长的蛋白的合成。
[0021]如上所述的丫-谷氨酷甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，步骤3)的具 体步骤为：
[0022] 将所述的gmas基因片段连接到克隆载体上，得到克隆载体-gmas;
[0023] 对克隆载体-gmas进行扩增；
[0024] 根据设计的酶切位点，将gmas基因片段从克隆载体-gmas上酶切下来，连接到经 过相同限制性内切酶切割的表达载体上，构建获得的重组载体即为丫-谷氨酷甲胺合成酶 的大肠杆菌表达质粒。
[0025]本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主 要两方面的原因：
[0026] 进克隆载体比进表达载体容易很多，可W尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或 者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；
[0027] 克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，运样在一些连接效率较低、 特异性不强的时候容易筛选。
[0028] 如上所述的丫 -谷氨酷甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法：
[0029] 所述克隆载体为pU巧7;
[0030] 所述表达载体为祀T-32a。
[0031]pET-32a便于原核表达，并且表达的蛋白具有tag,便于纯化。
[0032] 一种茶氨酸基因工程菌，所述茶氨酸基因工程菌是由上述的质粒转化至大肠杆菌 表达菌株中所得到。
[0033] 优选的，所述大肠杆菌表达菌株为Transetta。
[0034]Transetta可补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA) 对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。
[0035] -种如上所述的茶氨酸基因工程菌用于生产k茶氨酸的方法，包括如下步骤：
[0036] 1)、将所述基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的所述质粒具有抗性对 应的抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，筛选出抗性菌株；
[0037] 2)、将所述抗性菌株进行诱导培养，W诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用 SDS-PAGE方法检测丫-谷氨酷甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低溫离屯、所述发酵 培养基获得湿菌体；
[0038] 3)、利用所述湿菌体在生物转化反应体系中进行催化底物生成k茶氨酸。
[0039] 优选的，在步骤1)中，所述筛选培养的培养条件为：
[0040] 36~38°C恒溫倒置培养12~16h。
[0041] 优选的，在步骤2)中，所述诱导培养的具体培养过程为：
[0042] 将步骤1)中筛选出的抗性菌株接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的L