一种用于细胞培养二化螟脂肪体的收集方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于细胞培养二化螟脂肪体的收集方法。它的步骤如下：（1）制作蜡盘；（2）将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒；（3）无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫；（4）无菌滤纸吸干虫体；（5）将虫体置于用75%乙醇消毒过的解剖蜡盘中，用解剖针将头尾固定；（6）用消毒解剖剪刀沿二化螟背部从尾到头剪开，立即用无菌解剖针将剪开的皮肤固定在蜡盘上；（7）用镊子将附着在体腔上的脂肪体取下来，置于含有HBSS清洗液的培养皿中进行清洗；（8）将清洗好的脂肪体用镊子转移到细胞培养瓶中进行原代培养。本发明能在较短时间内快速、大量的获取二化螟原代培养所需要的脂肪体。可以有效解决二化螟脂肪体不易收集的难题。
【专利说明】
一种用于细胞培养二化螟脂肪体的收集方法
技术领域
[0001]本发明涉及属于昆虫解剖技术领域，尤其涉及一种用于细胞培养二化螟脂肪体的收集方法。
【背景技术】
[0002]随着生命科学的迅猛发展，在生物工程技术领域中，细胞工程已愈来愈受到重视。培养昆虫细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和生物化学以及昆虫毒理学等科学研究的重要方面。
[0003]脂肪体是昆虫生理生化研究的重要材料之一，是昆虫代谢的重要场所，也是代谢过程中各种物质储存和交换的场所。在昆虫的防御、抗冻、免疫、损伤应答等方面起重要作用。目前，脂肪体已成为昆虫研究中最常用的研究材料之一。由于昆虫大多个体较小，月旨肪体含量少，离体后容易发生干结和黑化反应，给收集工作带来一定难度。近年来，随着昆虫脂肪体研究的深入以及所研究昆虫种类的增多，收集昆虫脂肪体的方法也呈多样性，如何快速，大量，无污染的提取昆虫的脂肪体，是后续细胞培养的关键步骤。
[0004]二化螺CAiJo suppressalis (Walker)属鳞翅目，螺蛾科,是我国水稻上危害最为严重的常发性害虫之一，在分蘖期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成虫伤株和白穗，一般年份减产3%?5%，严重时减产在3成以上。除危害水稻外，二化螟还危害玉米、甘蔗、粟、蚕豆、茭白、高粱、油菜、小麦、紫云英等作物。二化螟有很强的适应能力，能快速适应不利环境(如抗性品种和杀虫剂)，其致害性能快速变异。在二化螟的防治过程中，新型生物农药的筛选和鉴定日益成为研究重点。生物农药的活动生物测定需要大量发育一致的二化螟试虫，对饲养场地要严格的要求，工作量大，而若有离体培养的二化螟细胞，则可以在离体条件下研究生物农药对二化螟的作用，从而有助于在细胞水平研究杀虫剂对二化螟的作用机制，有助于当前杀虫剂的改进和新杀虫剂的发明。通过本发明，可以有效提取二化螟脂肪体，建立二化螟细胞系，不仅能增加我国新昆虫细胞系的数量及种类，还能为日后该类昆虫细胞系的建立提供借鉴经验。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种用于细胞培养二化螟脂肪体的收集方法，为昆虫，特别是二化螟生理生化研究、毒理学研究以及生物反应器等提供技术支持和保障。
[0006]本发明通过以下技术方案完成:
(1)制作蜡盘；
(2)选取4-5龄二化螟幼虫，将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒10-15分钟；
(3)用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3-5次；
(4)用无菌滤纸吸干虫体；
(5)将虫体置于用75%消毒过的解剖蜡盘中，用无菌解剖针将头尾固定； (6)用消毒解剖剪刀在二化螟背部从尾到头剪开，立即用无菌解剖针将剪开的皮肤固定在蜡盘上；
(7)用消毒过的镊子将附着在体腔及皮肤内壁的脂肪体取下来，置于含有HBSS清洗液的培养皿中清洗2-3次；
(8)将清洗好的脂肪体用镊子转移到T-25cm2细胞培养瓶中进行原代培养，整个操作过程都是在无菌条件下进行的。
[0007]本发明的有益效果是:采用上述方案，可以大量，快速提取二化螟脂肪体，为二化螟的脂肪体原代培养提供材料。二化螟为水稻重要害虫，本发明有助于在离体条件下研究二化螟，为其防治途径的研究和新型生物农药的开发提供帮助。
[0008]本发明所提取的脂肪体用于细胞培养的效果观察
1.在上述操作后5天后可观察到大量增殖的单个细胞并逐渐向外围扩展(图1)
2.第40天后，增殖细胞铺满细胞培养瓶表面(图2);经实验观察，细胞系大部分贴壁生长，细胞的形状大部分圆形。把含有新增值的细胞，连同全部的细胞培养液吸出放入新培养瓶中，按照1:5 (细胞体积:最后培养液体积)进行传代培养。二化螟幼虫脂肪体细胞系初步建立成功。
【附图说明】
[0009]图1脂肪体培养5天的培养效果。
[0010]图2脂肪体培养40天的培养效果。
【具体实施方式】
[0011]以下结合实例对本发明作进一步的详细说明实施例1
蜡盘的制作
(1)将固体石蜡在烧杯中融化
(2)选取直径为9cm的培养皿，高温高压灭菌
(3)在无菌操作台内将(I)融化的石蜡倒入培养皿中
(4)将培养皿冷却，备用。
[0012]实施例2 二化螟脂肪体的提取
(O选取4龄二化螟幼虫，将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒10分钟；
(2)用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3次；
(3)用无菌滤纸吸干虫体；
(4)将虫体置于用75%消毒过的解剖蜡盘中，用无菌解剖针将头尾固定；
(5)用消毒解剖剪刀在二化螟背部从尾到头剪开，立即用无菌解剖针将剪开的皮肤固定在蜡盘上；
(6)用消毒过的镊子将附着在体腔及皮肤内壁的脂肪体取下来，置于含有HBSS清洗液的培养皿中清洗2次；
(7)将清洗好的脂肪体用镊子转移到T-25cm2细胞培养瓶中进行原代培养，整个操作过程都是在无菌条件下进行的。
[0013]
实施例3 二化螟脂肪体的提取
(O选取5龄二化螟幼虫，将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒15分钟；
(2)用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫5次；
(3)用无菌滤纸吸干虫体；
(4)将虫体置于用75%消毒过的解剖蜡盘中，用无菌解剖针将头尾固定；
(5)用消毒解剖剪刀在二化螟背部从尾到头剪开，立即用无菌解剖针将剪开的皮肤固定在蜡盘上；
(6)用消毒过的镊子将附着在体腔及皮肤内壁的脂肪体取下来，置于含有HBSS清洗液的培养皿中清洗3次；
(7)将清洗好的脂肪体用镊子转移到T-25cm2细胞培养瓶中进行原代培养，整个操作过程都是在无菌条件下进行的。
[0014]
实施例4 二化螟脂肪体细胞的原代培养
(O将清洗过的脂肪体置于预先盛有Iml细胞培养液的T-25cm2细胞培养瓶中，放入27°C无光照的细胞培养箱中培养；
(2)过夜后，待脂肪体贴壁后，再加入2ml细胞培养液，使脂肪体大部分浸没在该培养液中。注意在加液的时候勿使组织悬浮在细胞培养液中；
(3)每隔7天吸出和换入70%量的细胞传代培养液，直至扩展并增殖的细胞充满培养瓶。
【主权项】
1.一种用于细胞培养二化螟脂肪体的收集方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)制作蜡盘； (2)选取4-5龄二化螟幼虫，将二化螟幼虫浸没在75%乙醇溶液中，进行表面消毒10-15分钟； (3)用无菌蒸馏水清洗二化螟幼虫3-5次； (4)用无菌滤纸吸干虫体； (5)将虫体置于用75%消毒过的解剖蜡盘中，用无菌解剖针将头尾固定； (6)用消毒解剖剪刀在二化螟背部从尾到头剪开，立即用无菌解剖针将剪开的皮肤固定在蜡盘上； (7)用消毒过的镊子将附着在体腔及皮肤内壁的脂肪体取下来，置于含有HBSS清洗液的培养皿中清洗2-3次； (8)将清洗好的脂肪体用镊子转移到T-25cm2细胞培养瓶中进行原代培养； 整个操作过程都是在无菌条件下进行的。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蜡盘是将固体石蜡溶化后，倒入高温高压灭菌处理过的9cm培养皿中，在超净台中待其凝固备用。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的HBSS清洗液为HBSS溶液和青霉素、链霉素含量和两性霉素B的混合液。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于青霉素含量为200U/ml，链霉素含量为.0.2 μ g /ml,两性霉素B含量为0.5 μ g /ml。
【文档编号】C12N5/07GK105820995SQ201510004977
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】刘光富, 许益鹏, 马正
【申请人】中国计量学院