一种用于全悬浮培养昆虫细胞的无血清培养基及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种用于全悬浮培养昆虫细胞的无血清培养基，所述培养基由以下组分组成：Grace’s Insect Medium培养基，BFPM401培养基，葡萄糖2?4g/L，水解乳蛋白1?3g/L，PF68 1?3g/L，酵母粉2?5g/L。本发明还提供其制备方法和应用。经试验，本发明无血清培养基能够很好的全悬浮培养昆虫细胞，最大细胞增殖浓度分别为42.5×105/mL（培养Sf?21细胞）和45.4×105/mL（培养Hi?five细胞）。
【专利说明】
一种用于全悬浮培养昆虫细胞的无血清培养基及其制备方法 和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种用于全悬浮培养昆虫细胞的无血清 培养基。
【背景技术】
[0002] 杆状病毒表达系统(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)是以杆状病 毒为载体，在昆虫细胞上表达外源蛋白的真核表达系统。由于昆虫杆状病毒系统能高水平 地生产异源蛋白质，而且能保证异源蛋白质的生物活性而被被应用于医疗诊断、疫苗生产 方面。目前已上市的利用昆虫杆状病毒表达系统生产的疫苗有猪瘟疫苗、猪圆环病毒2型疫 苗、宫颈癌疫苗和治疗性前列腺癌疫苗等。另外，2013年美国Π)Α批准了Flublok用于19至 49岁人群季节性流感的预防，Flublok也成为第一个用昆虫杆状病毒表达系统的流感疫苗。
[0003] 到目前为止，全世界建立的昆虫细胞系有800株以上，研究和应用最多的是草地贪 夜蛾细胞系Sf-21及其克隆株Sf-9。上世纪90年代Granados和李国勋等人从粉纹夜蛾卵巢 细胞系BTI-TN-5B1克隆得到了具有外源基因高表达的新型宿主细胞，尤其对多角体病毒增 殖能力和重组蛋白表达水平特别高，BTI-TN-5B1-4因此而驰名，成为昆虫杆状病毒表达系 统的后起之秀，在商业上称之为"高五"细胞，简称"Hi-five"，在生物医药、动物病毒疫苗研 究中开始广泛应用。由于以上三种昆虫细胞在静置培养时呈半贴壁状态生长，很容易驯化 成适应悬浮培养的细胞株。
[0004] 随着昆虫细胞体外培养的需要，昆虫细胞培养基的研究当然必不可少，目前成分 稳定且广泛应用的商品化基础培养基有Grace' S、IPL-41和TC-100,使用时通常要加 10%的 牛血清和4g/L酵母浸出液才能正常培养，由于使用时添加动物血清增加了生物安全的风险 和下游纯化工艺，另外酵母浸出液价格很贵。无血清培养基主要有Thermo Fisher Scientific公司的Sf-900TM、Express Five? SFM和HyQ SFX_Insect，LONZA公司的 fesect-XPRESSrM ,Sigma-Aldrich公司的EX-CELL ? 405、420和TiterHigliTM Medium 等。这些产品均为国外公司生产，由于中国没有相应的产品竞争，外国公司给中国用户的卖 价很高，如IL包装的液体EX-CELL ? 405给中国用户的直销价为650元，导致工业用户无法 生产。
[0005] Grace's Insect medium在一种基础培养使用时需要加血清和酵母浸出液才能维 持昆虫细胞生长。无血清培养基BFPM401是一种国产的适合哺乳动物细胞高密度的培养基， 目前没有在昆虫培养中进行过培养的报道，本发明中单独培养后细胞生长也不理想。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于全悬浮培养昆虫细胞的 无血清培养基，为应用昆虫细胞杆状病毒表达系统的研究和生产提供支撑。为此，本发明还 提供其制备方法和应用。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种用于全悬浮培养昆虫细胞的无血清培养基，所述 培养基由以下组分组成:Grace's Insect Medium培养基，BFPM401培养基，葡萄糖2-4g/L， 水解乳蛋白 l_3g/L，PF68 l-3g/L，酵母粉2-5g/L。
[0008] 作为优选，所述培养基由以下组分组成:Grace's Insect Medium培养基，BFPM401 培养基，葡萄糖3 · 075g/L，水解乳蛋白1 · 35g/L，PF68 2g/L，酵母粉4g/L。
[0009] 本发明的第二个目的是提供上述无血清培养基的制备方法，IOL无血清培养基的 制备步骤如下： (1) 配制50倍酵母粉浓缩液:按照50倍浓缩液来计算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反复搅拌后置2-8°C下过夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分搅拌后过滤得浓缩液； (2) Grace's Insect Medium配制:配制略小于4.85L的溶液，其中各种溶质的用量为5L 溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (3 )无血清培养基BFPM401配制:配制略小于4.85L的溶液，其中各种溶质的用量为5L溶 液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (4)将以上两种培养基合并到一起搅拌后，加入20-40g葡萄糖、10-30g水解乳蛋白、 100-250ml浓度50倍的酵母粉浓缩液和10-30g PF68，简单搅拌后再加12.752g碳酸氢钠后 充分混匀，定容至IOL，调pH值到6.1 -6.2，即得。
[0010] 作为优选，IOL无血清培养基的制备步骤如下： (1) 配制50倍酵母粉浓缩液:按照50倍浓缩液来计算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反复搅拌后置2_8°C下过夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分搅拌后过滤得浓缩液； (2) Grace' s Insect Medium配制：配制略小于4.9L的溶液，其中各种溶质的用量为5L 溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (3) 无血清培养基BFPM401配制:配制略小于4.9L的溶液，其中各种溶质的用量为5L溶 液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (4) 将以上两种培养基合并到一起搅拌后，加入30.75g葡萄糖、13.5g水解乳蛋白、 200ml浓度50倍的酵母粉浓缩液和20g PF68，简单搅拌后再加12.752g碳酸氢钠后充分混 匀，定容至10L，调pH值到6.16,即得。
[0011] 本发明的第三个目的是提供上述无血清培养基在全悬浮培养昆虫细胞中的应用。
[0012] 作为优选，所述昆虫细胞为Sf-21或Hi-five细胞。
[0013] 本发明的第四个目的是提供一种全悬浮培养昆虫细胞的方法，将昆虫细胞接种至 权利要求1所述的培养基中，不添加血清，置27-28°C 80-120rpm摇床培养。
[0014] 作为优选，所述昆虫细胞为Sf-21或Hi-five细胞。
[0015] 作为优选，所述接种时接种量为4.0-7.0 X IO5AiL。
[0016] 作为优选，将昆虫细胞接种至权利要求1所述的培养基中，不添加血清，置28°C IOOrpm摇床培养。
[0017] 本发明的目的是提供一种用于昆虫细胞全悬浮培养的培养基，所述培养基是 Grace ' s Insect medium培养基和无血清培养基BFPM401以1:1比例混合培养基作为为基 础，添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等组成，适合昆虫细胞的高密度悬浮培 养。用价格便宜的酵母粉制成溶液替代价格高的酵母浸出液，降低成本。本发明的培养基的 具体组分如表1-1至表1-4所示。
[0018]表1-1本发明的用于昆虫细胞全悬浮培养的培养基的具体配方(单位:g/L)
表1-2本发明的用于昆虫细胞全悬浮培养的培养基的具体配方(单位:g/L)
表1-3本发明的用于昆虫细胞全悬浮培养的培养基的具体配方(单位:g/L)
表1-4本发明的用于昆虫细胞全悬浮培养的培养基的具体配方(单位:g/L)
配制方式： 浓度50倍的酵母粉浓缩液配制：按1000 ml注射用水中加200g酵母粉的比例称取酵母 粉，先用50%注射用水完全溶解酵母粉后放置在2-8°C下过夜，补足注射用水后搅拌后单层 普通滤纸过滤杂质后备用。
[0019] 两种培养基中各组分的用量参照表1，然后按配制说明书分别配制溶解后(此处先 不加碳酸氢钠，注射用水加入大部分)混合到一起，再加入葡萄糖2_4g/L，水解乳蛋白l_3g/ L，PF68 l-3g/L，酵母粉浓缩液(酵母粉最终浓度为2-5g/L)充分混匀后，最后加碳酸氢钠 1.2752g/L(原配方有中，到配液的这一步才加），定容，用IN氢氧化钠或IN盐酸调pH值到 6.1 -6.2，过滤除菌即得，在2-8 °C保存。
[0020] 昆虫细胞（Sf-21或 Hi-five)以4.0-7.0\105/11^接种，不添加血清，在27-281€ 80-120rpm摇床培养，每24h计数细胞密度。
[0021] 经试验，本发明的无血清培养基能够很好的全悬浮培养昆虫细胞，当无血清培养 基的配方为:Grace ' S Insect Medium培养基，BFPM401培养基，葡萄糖3.075g/L，水解乳蛋 白1.35g/L，PF68 2g/L，酵母粉4g/L，培养基pH值为6.16时，细胞增殖浓度最大，最大细胞增 殖浓度分别为42.5 X 105/mL(培养Sf-21细胞)和45.4 X 105/mL(培养Hi-five细胞）。
【附图说明】
[0022]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实 施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中： 图1商品化培养基Grace's Insect medium加10%新生牛血清培养昆虫细胞的生长曲 线； 图2商品化培养基BFPM401加10%新生牛血清培养昆虫细胞的生长曲线； 图3商品化培养基Grace's Insect medium:BFPM401(l:l)无血清培养昆虫细胞的生 长曲线； 图4本发明的无血清培养基和商品化昆虫细胞无血清培养基(HyQ SFX-Insect)培养 sf-21细胞的结果比较图； 图5本发明的无血清培养基和商品化昆虫细胞无血清培养基(HyQ SFX-Insect)培养 Hi-five细胞的结果比较图； 图6本发明的无血清培养基培养sf-21细胞的形态图（48h，20X); 图7本发明的无血清培养基培养Hi-five细胞的形态图（48h，20X)。
【具体实施方式】
[0023]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市 售。
[0024] 实施例1 1材料与设备 1.1材料 昆虫细胞:Sf-21、Hi-five(甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供）； 培养基：Grace's Insect Medium干粉（Gibco)，无血清培养基BFPM401干粉(兰州百 灵生物）； 对照用培养基HyQ SFX-Insect SFM(Hycl〇ne，为液体，直接使用），葡萄糖（国药集团）， 水解乳蛋白（HyClone)，Pluronic F_68(Gibco)，酵母粉（Organotechnie)等。
[0025] 1.2设备 倒置相差显微镜（CK40-32PH型，Olympus)，细胞计数仪(CASY TT型，INN0VATIS)，电子 天平(AR2140型，上海奥豪斯），摇床(2102C型，上海智诚），pH计(MP120-BLE型，梅特勒)等。
[0026] 2 方法 2.1配液 浓度50倍的酵母粉浓缩液配制:称取200g酵母粉溶解到500ml注射用水中，反复搅拌后 置2-8°C冰箱，过夜后取出再加500ml注射用水充分搅拌后用单层普通滤纸过滤后备用。
[0027] Grace's Insect Medium配制：配制略小于4.85L的溶液，其中各种溶质的用量为 5L溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书(先不加碳酸氢钠）。
[0028] 无血清培养基BFPM401配制：配制略小于4.85L的溶液，其中各种溶质的用量为5L 溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书(先不加碳酸氢钠）。
[0029]将以上两种培养基合并到一起简单搅拌后，加入20_40g葡萄糖、10_30g水解乳蛋 白、100-250ml浓度50倍的酵母粉浓缩液和10-30g PF68，简单搅拌后再加12.752g碳酸氢钠 后充分混匀，定容至IOL，调pH值到6.16，过滤除菌在2-8 °C保存备用。
[0030] 2.2细胞培养 细胞复苏：用对照培养基HyQ SFX-Insect SFM按常规方法从液氮分别复苏Sf-21 di-five 细胞 ，置 27 °C IOOrpm 摇床培养 ，每 24h 计数细胞密度 。等细胞生长致密度达到2 X IO6AiL 以上时进行本发明培养基的测试。
[0031] 每一种细胞按6.0 X IO5AiL分别用本发明的培养基和对照培养基HyQ SFX-Insect SFM接种培养，不添加血清，置27 °C IOOrpm摇床，每24h计数细胞密度，连续培养三代，绘制三 个代次细胞计数平均值的生长曲线。
[0032] 3结果 用本发明的无血清培养基和对照培养基HyQ SFX-Insect SFM分别培养Sf-21、Hi-five 细胞，细胞生长均较好，能够很好的全悬浮生长。用本发明的无血清培养基培养的两种细胞 的最大增殖浓度均稍高于进口对照用培养基HyQ SFX-Insect SFM。
[0033] 经试验，当无血清培养基的配方为:Grace's Insect Medium培养基，BFPM401培养 基，葡萄糖3.075g/L，水解乳蛋白1.35g/L，PF68 2g/L，酵母粉4g/L;培养基pH值为6.16时， 细胞增殖浓度最大，此时，细胞计数结果的平均值见表2,生长曲线见图4和图5,细胞形态见 图6和图7。
[0034] 表2两种细胞培养三代计数结果平均值表（X IO5AiL)
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对 前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。
【主权项】
1. 一种用于全悬浮培养昆虫细胞的无血清培养基，其特征在于:所述培养基由以下组 分组成:Grace ' s Insect Medium培养基，BFPM401培养基，葡萄糖2-4g/L，水解乳蛋白l-3g/ L，PF68 l-3g/L，酵母粉2-5g/L。2. 根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：所述培养基由以下组分组成： Grace' s Insect Medium培养基，BFPM401 培养基，葡萄糖3.075g/L，水解乳蛋白 1.35g/L， PF68 2g/L，酵母粉4g/L。3. 权利要求1所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于：10L无血清培养基的制备 步骤如下： (1) 配制50倍酵母粉浓缩液:按照50倍浓缩液来计算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反复搅拌后置2_8°C下过夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分搅拌后过滤得浓缩液； (2) Grace ' s Insect Medium配制：配制略小于4.85L的溶液，其中各种溶质的用量为5L 溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (3) 无血清培养基BFPM401配制：配制略小于4.85 L的溶液，其中各种溶质的用量为5L 溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (4) 将以上两种培养基合并到一起搅拌后，加入20-40g葡萄糖、10-30g水解乳蛋白、 100-250ml浓度50倍的酵母粉浓缩液和10-30g PF68，简单搅拌后再加12.752g碳酸氢钠后 充分混匀，定容至10L，调pH值到6.1 -6.2，即得。4. 权利要求2所述的无血清培养基的制备方法，其特征在于：10L无血清培养基的制备 步骤如下： (1) 配制50倍酵母粉浓缩液:按照50倍浓缩液来计算酵母粉和注射用水用量，先用一半 重量的注射用水完全溶解酵母粉后，反复搅拌后置2_8°C下过夜，取出后再加入另一半重量 的注射用水，充分搅拌后过滤得浓缩液； (2) Grace ' s Insect Medium配制：配制略小于4.9L的溶液，其中各种溶质的用量为5L 溶液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (3) 无血清培养基BFPM401配制：配制略小于4.9L的溶液，其中各种溶质的用量为5L溶 液时溶质的用量，配制方法参见说明书，先不加碳酸氢钠； (4) 将以上两种培养基合并到一起搅拌后，加入30.75g葡萄糖、13.5g水解乳蛋白、 200ml浓度50倍的酵母粉浓缩液和20g PF68，简单搅拌后再加12.752g碳酸氢钠后充分混 匀，定容至10L，调pH值到6.16,即得。5. 权利要求1或2所述的无血清培养基在全悬浮培养昆虫细胞中的应用。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述昆虫细胞为Sf-21或Hi-five细胞。7. -种全悬浮培养昆虫细胞的方法，其特征在于:将昆虫细胞接种至权利要求1所述的 培养基中，不添加血清，置27-28 °C 80-120rpm摇床培养。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述昆虫细胞为Sf-21或Hi-five细胞。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述接种时接种量为4.0-7.0 X 105/mL。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于:将昆虫细胞接种至权利要求1所述的培养 基中，不添加血清，置28°C lOOrpm摇床培养。
【文档编号】C12N5/07GK105861416SQ201610391655
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】马忠仁, 乔自林, 马桂兰, 冯玉萍, 马伟, 王家敏, 马祺
【申请人】西北民族大学