相对于亲本HepG2 SC细胞，在N-Cad herin中 的EFla 2. 3、CMV 2. 31和CMV2. 60细胞，分别有2. 9、2. 9和2. 4倍的增长。蜗牛实验的分 析还显示，EF1A2. 3显著增加2. 6倍、CMV 2. 31显著增加6倍、巨细胞病毒2. 60显著增加 4. 3倍。遵循相同的趋势，EFlA 2. 3-1. 7倍，巨细胞病毒2. 31-5倍和巨细胞病毒2. 60-1. 6 倍；与SC细胞HepG2相比，这也体现了一个巨大的增长。
[0046] 实施例3 :针对肿瘤干细胞标志物的DC疫苗
[0047] 树突状细胞来源于人外周血单个核细胞（PBMC)。PBMCs是采用Ficoll Gradient Ficoll-Paque?技术（GE医疗生命科学）从新鲜的白细胞层中分离出来的。本发明使用 的冷冻/解冻的肝癌肿瘤干细胞生成溶解产物和人类外周单个核细胞-衍生的树突状细 胞与溶解产物。为了研究产生的树突状细胞的启动能力，T细胞从easysep?人初始CD8+T 细胞富集试剂盒的外周血单个核细胞被分离出来（干细胞分离技术）。还未成熟的T细胞 在专门培养T细胞的Cellgro培养基中培养，加入5%的人类AB血清（美国生命技术公 司）、IL-2 (为50IU/ml)、20ng/ml IL-7 (为）启动初始T细胞和成熟树突状细胞的比例是 1 : 2. 5，1 : 5或1 : 10。在上述细胞培养基上培养和扩大。混合细胞1周之后，进行新 一轮的抗原脉冲刺激，成熟和已经启动的初始T细胞和T细胞就开始进行扩张。经过2轮 启动后，据T细胞表型分析，在T细胞群，不同功能的子集进行了表征，尤其是那些记忆T细 胞所表达淋巴结归巢信号CCR7。中央记忆细胞（⑶45R0/CCR7+)被认为迀移到淋巴组织，而 缺乏淋巴结归巢信号的效应记忆细胞（⑶45R0/CCR7-)被认为主要是在外周组织。效应记 忆T细胞可迅速形成Thl反应，产生效应细胞因子如IFN-Y和IL-4 Y，从而形成第一道免 疫防御。本发明观察到在初始T细胞标记物显著下降（CCR7+⑶45RA+)从1 : 10(37. 5%) 的比例变成1 : 2. 5 (16. 8% ) (DC预激后的T细胞特性结果如图5所示）。更重要的是，其 在效应记忆T细胞标记物的表达增加了（CCR7-⑶45RA-)，从36. 7%到57. 5%。这些结果表 明，增加脉冲树突状细胞数量会增加初始T细胞分化的效应记忆T细胞。然而，过量的脉冲 树突状细胞可能导致成熟的前T细胞疲惫进而影响他们的生存能力和杀伤能力。因此，本 发明认为，成熟树突状细胞和初始T细胞按1 : 5的比例共培养也许会生成很多的具有抗 肿瘤效果的细胞毒性淋巴细胞。
[0048] 使用如上所述的优化直流脉冲和初始T细胞的启动条件，ELISP0T试验确定肝 癌CSC样细胞可以用来制备具有肝癌CSC抗原特异性的靶向CTL。酶联斑点试验（瑞典， MabTech AB)HLA-A2+T2细胞被用来作为靶向细胞。对于CSC相关抗原的表达，T2细胞在 Ce 11 gro培养基分别孵育10 y g/mL Oc t4、Sox2、EpCAM和EGFP肽，条件为无血清的Ce 11 gro 介质、温度37°C、C02浓度为5%。T细胞应答后产生的启动HLA-A2+初始T细胞的自体脉 冲树突状细胞分别与T2靶向细胞以10 : 1的比例目标培养，在Cellgro培养基内加入5% 人类AB血清用96孔板节流Cellgro介质。培养4h后，细胞转入ELISP0T板孵育培养一 夜。根据制造商的指示进行抗原特异性T细胞的检测。开发出相应的IFNy干扰素产生细 胞，使用自动读板CTL-biospot?.S6紫外分析仪（美国俄亥俄州，Cellular Technology Limited)进行扫描和分析。当将所产生的T细胞混合T2脉冲与0CT4 (69)、S0X2 (63)和 EpCAM (119)肽与对照组（未经过脉冲=29,绿色荧光蛋白=33) (ELISP0T测定具有CSC抗 原特异性的CTL的产生结果如图6、图7所示）结果是每5x104个细胞中含有能分泌干扰 素-Y的细胞个数。结果由三个独立的实验而来，表述形式平均数土标准差。
[0049] 比较观察时，观察到IFN-Y产生斑点的数量显著增加。测试显著增加T细胞反应 与IFN- 丫 ELISP0T检测证明所产生的细胞毒性T淋巴细胞（CTL)的溶解作用，具体的测试 癌症干细胞抗原包括0ct4 (69)、Sox2 (63)和EpCAM。这些结果证实人类树突状细胞负载肿 瘤干细胞标志物表达的肝癌细胞裂解物能够在自体T细胞引起抗CSC抗原反应。由于肿瘤 干细胞是罕见的肿瘤细胞，因此要获得足够的资源和特定的CSC抗原量是很困难的。本发 明的方法填补了 DC免疫治疗针对肿瘤干细胞的技术差距，即利用0ct4/S〇x2表达所形成的 类肿瘤干细胞的细胞体作为通用的肿瘤抗原的基因来源。
[0050] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的制备使用0ct4和Sox2基 因高表达的肝癌细胞株。2. 如权利要求1所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述制备疫苗的肝癌细胞株基 因组的AAVSl位点中插入了 0ct4和Sox2基因。3. 如权利要求2所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述肝癌细胞株AAVSl位点位 于基因编码的蛋白磷酸酶1调节亚基内，调节位于人类基因组的19号染色体亚基12C，即 ppplrl2c上；是非致病性腺相关病毒的特异性结合位点2型。4. 如权利要求2所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述插入肝癌细胞株AAVSl位点 中的0ct4基因序列长度为1080 ;所述Sox2基因序列长度为951。5. 如权利要求1所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗将肝癌干 细胞通过细胞诱导技术诱导扩增而来。6. 如权利要求5所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述肝癌干细胞是由修改后的 0ct4和Sox2基因高表达的肝癌细胞株，通过肿瘤干细胞球体形成法富集而来。7. -种制备如权利要求1所述的疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 采用杆状病毒-锌指核酸酶技术向肝癌细胞株基因组的AAVSl位点中插入0ct4和 Sox2基因，制备得到修改后的肝癌细胞； (2) 对所述的修改后的肝癌细胞，采用肿瘤干细胞球体形成法富集类肝癌干细胞，提升 肝癌干细胞标记物的表达； (3) 由自体血分离制备单核细胞，加入细胞因子诱导扩增抗原递呈树突状细胞，然后用 类肝癌干细胞冻融裂解液刺激树突状细胞以获得负载肝癌干细胞抗原的抗原递呈树突状 细胞。8. 如权利要求1-6任一所述疫苗和权利要求7所述方法在肝癌免疫领域的应用。
【专利摘要】本发明涉及医学生物工程技术领域，具体涉及一种树突状细胞疫苗及其制备方法与应用。公开了一种制备针对肝癌干细胞的人树突状细胞(DC)癌症疫苗方法：用锌指核酸酶技术向肝癌细胞株基因组的AAVSl位点中插入Oct4和Sox2基因；采用肿瘤干细胞球体形成法，从修改过的肝癌细胞中富集了类肝癌干细胞；用类肝癌干细胞冻融裂解液刺激自体血分离制备的树突状细胞得负载肝癌干细胞抗原的抗原递呈DC细胞，建立的肝癌干细胞株能高水平地表达肝癌干细胞的分子标记物，显著提升CDl3、CD90和EpCAM等数个肝癌干细胞标记物的表达，特异性强；采用的抗原递呈树突状细胞源自自体血、安全性高，毒副作用小；制备DC细胞癌症疫苗经试用后显著激发肿瘤干细胞特异性细胞毒性效应CTL反应。
【IPC分类】A61P1/16, A61P35/00, C12N5/10, A61K39/00, C12N5/0784
【公开号】CN105031632
【申请号】CN201510334814
【发明人】卓朗, 王晖, 王柯
【申请人】深圳市科晖瑞生物医药有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月16日...