一种马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测马尔尼菲青霉菌的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] Jk马來尼苹着霉病QPSM Penicilliosis marneffef)是一种由马尔尼菲青霉（/W fflaraeiTei)引起的广泛播散性感染，是一种机会感染性致死性真菌病。马尔 尼菲青霉属于半知菌、丝孢菌纲、丝孢目、丛梗孢科、青霉属。其特征是青霉属（>270种）中 唯一的呈温度双相型致病菌，在自然界以菌丝形式存在，在组织中则可形成小的圆形到椭 圆形细胞。
[0003] 马尔尼菲青霉病在世界各地均有报道，但以东南亚发病最多，如泰国北部、越南、 印度、老挝、中国的广西、广东、香港等地区，并被认为是以上地区的流行病。20世纪80年代 以前，本病极少报道，但随着艾滋病（AIDS)的出现及流行，东南亚一带本病逐年增多，现已 成为常见的系统性真菌病，是AIDS常见的机会性感染之一。我国最早于1985年广西报道 该病1例，以后报道逐渐增加，至今全国有超过12个省或直辖市报道发现本病，以华南地区 特别是广西、广东两省为最多。
[0004] 马尔尼菲青霉病的传染源及传播途径尚未明了，主要的中间宿主为竹鼠。该病发 病隐匿，临床表现复杂，治疗困难，病死率可达91. 3%。其生存率与早期诊断密切相关，因此， 如何快捷、高效、准确地诊断马尔尼菲青霉病就显得格外重要。
[0005] 目前诊断马尔尼菲青霉病包括传统方法、血清学方法及分子生物学诊断方法。传 统方法包括常规实验室检查、直接涂片及真菌培养、组织病理学检查、免疫学检查、放射学 检查，这些传统方法除真菌培养外特异性均不强，而真菌培养耗时较长，一般需1-2周时 间；血清学方法主要是用ELISA方法检测，以A fflaraef/ei的甘露糖蛋白（Mplp)及半乳甘 露聚糖为抗原，血清学诊断虽然敏感性较高，但是方法复杂、需要较高的实验条件，耗费高， 且尚欠缺大量的临床标本做前瞻性临床评定，而且部分检测方法特异性较低，与其他真菌 存在交叉性；因此该方法目前还没有用于临床；分子生物学利用rDNA的核糖体转录间隔 (internal transcribed spacers，ITS)序列分析已成熟应用于多种病原真菌的鉴定，常用 的检测方法包括巢氏PCR、荧光定量PCR及滚环扩增。虽然PCR方法较常规方法快速准确， 但需要复杂的仪器设备，成本较高，不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测马尔尼菲青霉菌的方法， 公开一种快速、可视化并且可实时定量的检测马尔尼菲青霉菌的环介导等温扩增试剂盒。 为实现本发明目的所使用的技术方案为： 一种马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2X反应缓冲 液、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和马尔尼菲青霉菌DNA模板，所述的LAMP引 物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)和内引物FIP(SEQIDN0 :3)与 BIP (SEQ ID NO :4); 其中引物的序列分别为： F3 TCAAAGCTACTCTGG B3 TGGAGACCAATTCGC FIP CAGGGCCAAGGGCAGTCCCTCCAAAATGAGC BIP AGGAACCTCTTGTTCAGGCTGGCCTCCTCCTGTTGTTGCCTAAG ； 所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine 和 dNTPs〇
[0007] 以上所述的马尔尼菲青霉菌DNA模板提取是使用细菌基因组提取试剂盒提取马 尔尼菲青霉菌培养物或临床分离真菌的基因组DNA。
[0008] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0009] 以上所述的 2X 反应缓冲液包括 Tris-HCL 45-50mM、KCL 25-30mM、MgSO4 18-25mM、（NH4)2SO4 22-28mM、Tween20 0· 3-0. 8 %、Betaine 2-3. 5M 和 dNTPs3-5 mM，其配 制方法在pH为8. 8左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] 一种马尔尼菲青霉菌环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似马尔尼菲青霉 菌，具体检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 马尔尼菲青霉菌DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
[0011] 以上所述的LAMP反应体系建立LAMP以25 μ L计， 2X反应缓冲液 12. 5 yL Bst DNA聚合酶 IyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 马尔尼菲青霉菌DNA 2 μ L 超纯水 补足25 μ L。
[0012] 以上所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的 方法。
[0013] 以上所述的LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控， 反应温度为63 °C、反应在30分钟左右出现扩增。
[0014] 本发明的实质性特点和进步是： 1)特异性强 本发明的LAMP检测方法特异性检测出马尔尼菲青霉菌，所检测的对照真菌和细菌以 及水对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。
[0015] 2)灵敏度高 普通的PCR检测方法的灵敏度为I. 7X 10_6 ng/ μ L数量级，而使用本发明检测的LAMP 方法，检测限约为1.7 X10_7 ng/μ L，敏感性是普通PCR的10倍。
[0016] 3)迅速得出结果 普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在 反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从真菌基因组DNA提取 到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在30分钟左右出 现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判定方式简便一扩增结束即可判断结果，不需要再 进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在 2-3小时内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反 应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。但显色法只能是反 应结束后开盖加入荧光染料进行显色反应，观察是否有显色来判读试验结果，或者通过跑 电泳的方法进行结果判定，无法区分特异性扩增与非特异性扩增，因此增加了假阳性诊断 结果的几率；而且对于弱阳性反应，通过人为肉眼判读的方式很可能误判为阴性；此外，通 过电泳的方法来判读结果的方式，增加了试验成本、耗时间且容易造成实验室污染。而本发 明的LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不 进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污 染。
[0018] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeter real-time LA-320C池度仪来实时分析LAMP反应的结果，不 同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求 出各时间的马尔尼菲青霉菌拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本方明LAMP方法特异性检测结果；其中1、马尔尼菲青霉菌；2、烟曲霉菌； 3、腐皮镰刀菌；4、棘状外瓶霉菌；5、大肠杆菌；6、嗜水气单胞菌；7、哈氏孤菌；8、创伤孤菌； 9、水对照。结果显示1株马尔尼菲青霉菌反应管出现浊度的上升曲线，7株阴性对照菌反应 管和水对照反应均无扩增。
[0020] 图2和图3是本发明LAMP方法及传统PCR方法的敏感性检测结果；I :1. 7X IO1 ng/yL ；2 ：1, 7X10° ng/μ L ；3 ：1. 7Χ10-1 ng/μ L ； 4 :1. 7 X KT2 ng/μ L ;5 :1. 7 X l(T3ng/ yL ；6 ：1. 7X10-4 ng/μ L ；7 ：1. 7Χ10-5 ng/μ L ；8 ：1. 7Χ10-6 ng/yL ；9 ：1. 7X10-7 ng/μ L ； 10 :1· 7Χ ICT8 ng/ μ L ;11 :water〇
[0021] 重组质粒pMD18-T-#^勺起始浓度为1.7X10ng/yL，经10倍倍比稀释后进行 LAMP和PCR扩增，结果显示LAMP法检测限约为I. 7X KT7 ng/ μ L，而PCR法检测限为 I. 7 XKT6 ng/μ L0
[0022] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：右管为以马尔尼菲青霉菌基因组DNA为模 板的反应情况，为阳性结果，左管为阴性对照的反应情况，为阴性对照结果。
[0023] 图5是本发明定量检测马尔尼菲青霉菌的标准曲线；利用不同的标准样品的浓度 对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的马尔尼菲 青霉菌拷贝数。
【具体实施方式】
[0024] 1、材料的准备 马尔尼菲青霉菌、烟曲霉菌、腐皮镰刀