专利名称：一种玫烟色拟青霉菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种玫烟色拟青霉菌(Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brownet Smith)菌株，及其在防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫和小菜蛾等害虫方面的应用。
背景技术：
在烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫、小菜蛾等害虫的防治上，多采用传统的化学防治方法，在生物农药防治方面未发现用于防治上述害虫的玫烟色拟青霉菌株。该菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，可以作为防治某些对苏云金杆菌(Bt)产生抗药性的昆虫的替代防治药物。
发明内容
为了防治烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫、小菜蛾等害虫，本发明的首要目的在于提供一种玫烟色拟青霉菌菌株。
本发明的另一目的在于提供上述玫烟色拟青霉菌菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现一种玫烟色拟青霉菌菌株，所述玫烟色拟青霉菌是从广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱虫体上分离获得，将野生菌株回接于烟粉虱虫体上复壮获得玫烟色拟青霉菌菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。该菌株为PF01-N10，菌株保藏号CCTCC NoM207088，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。所述的玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown et Smith菌株PF01-N10，属丝孢目，拟青霉属。
所述玫烟色拟青霉菌落背面无色或黄色，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5～2μm，壁光滑，透明，大多由着生4～6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7～8×1～2μm。分生孢子柱形至梭形，光滑，透明至微淡红色，3～4×1～2μm，无厚垣孢子。
上述玫烟色拟青霉菌菌株在制备防治烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫、小菜蛾等药物中的应用。本发明的玫烟色拟青霉菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫、小菜蛾等多种害虫有效。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本菌株从广东省广州地区被侵染的烟粉虱虫体上分离获得，为中国本土的菌株，并非从国外引进，能适应本地的自然环境。该玫烟色拟青霉菌是一种昆虫病原真菌，作为一种活体生物农药，具有不同于现有化学杀虫剂的全新的作用机理、对环境无污染、无残留的特征，适应了有机食品生产的要求。本发明的玫烟色拟青霉菌对防治十字花科蔬菜上的烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫、小菜蛾等多种害虫有效。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 1.1材料来源 在广州地区的蔬菜黄瓜上采集到一种被虫真菌侵染的烟粉虱Bemisiatabaci虫尸。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)将200g马铃薯煮熟取汁，然后在所取的汁液中加入20g葡萄糖+17～20g琼脂粉，加入水使总体积为1000ml并煮沸。后经高压灭锅灭菌(121℃，30min)。
无菌操作条件所有器皿和用具须经高压灭锅灭菌(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。
培养条件置于25℃光照(14L10D)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。
1.2病原菌的分离、鉴定 (一)病原菌的分离与纯化 (1)分离 从采回的被虫生真菌感染的烟粉虱虫尸样品上分离病原菌。利用5％的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中洗涤3次，并放入PDA平板中，倒置于25℃恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到PDA斜面，再转入4℃冰箱贮存。
(2)复壮 将分离到的菌株在PDA平板上培养7天，待形成菌落后加入0.3％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，用小型手动喷雾器将稀释成1×107孢子/ml的孢子悬浮液均匀地喷于带有烟粉虱的黄瓜叶片上，保温90％以上，24小时。10天后挑取被感染的烟粉虱，按前面所述的方法分离到A分离株。
(3)纯化 对A分离株分别在PDA平板上培养10d，待形成玫烟色孢子后，挑取分生孢子制成1×103孢子/ml的孢子悬液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入PDA培养基上，放在培养箱中培养，获得B、C、D、E、F、G、H、I共8个分离株。
(4)病原菌的鉴定 根据病原菌的培养性状、菌丝、分生孢子和产孢器的形态进行初步鉴定。
1、菌落形态描述 将获得的8个分离株接种到PDA平板上，于25℃条件下培养。2-3天可见到长出白色的菌丝，菌落长绒状、白色、中部隆起，第5d产生玫烟色粉末状孢子。菌落背面无色或黄色。
2、菌丝和孢子形态描述 分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5～2μm，壁光滑，透明，大多由着生4～6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7～8×1～2μm。分生孢子柱形至梭形、光滑、透明至微淡红色，3～4×1～2μm，无厚垣孢子。
(二)玫烟色拟青霉分离株的筛选 虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性，又存在有准性生殖现象，同种真菌的不同菌株对目标害虫的致病力差异显著，菌株不同，其LD50、LT50可相差数倍至数十倍。高产优质菌株的筛选与获得，是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选常用的4个指标分别为致病力、产孢量、孢子萌发率、菌落生长速率。本发明以这些指标为依据，筛选玫烟色拟青霉的优势菌株。
(1)供试菌株的处理 经纯化后获得的玫烟色拟青霉B、C、D、E、F、G、H、I共8个分离株，在PDA平板于25±0.5℃的恒温箱(14L10D)中培养。
(2)供试昆虫与寄主植物 烟粉虱，将网室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫，接种到无虫的黄瓜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将黄瓜幼苗置于25±0.5℃的光照培养箱中，待烟粉虱发育至2龄若虫时待用。黄瓜Cucumis sativus L.，品种为万吉青瓜，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用2～3片展开叶的盆栽苗。
(3)菌落生长速率和产孢量的测定 将8个分离株分别配制成1×107孢子/ml的分生孢子悬液，分别取1ml悬液滴入PDA培养基上，用三角玻璃棒涂匀，待1～2d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器新鲜菌落，接种于PDA平板上，然后置于培养箱中培养(L∶D＝14∶10)。每个菌株5次重复。第10d测定菌落直径并收集分生孢子用血球计数板记数测定产孢量。具体操作如下用直尺测量菌落直径，并用直径为5mm的灭菌打孔器在培养皿中取菌丝生长均匀的菌块，然后放入加有20ml0.3％吐温-80无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌20分钟，使孢子充分分散，制成孢子悬浮液，用血球记数板记数测定产孢量。
8个分离株的菌落生长速率和产孢量见表1，菌落生长速率除C、F、I与B、G、H差异显著外，其余的分离株之间差异不显著，其中H分离株的菌落生长速率最大，C分离株的菌落生长速率最小。生长10d后，除分离株C与B、D、G和I的产孢量差异显著外，其它分离株之间的产孢量差异不显著，其中G分离株的产孢量最高。
表1玫烟色拟青霉8个分离株生长速率和产孢量(10d) 注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。
(4)孢子萌发率的测定 将8个分离株分别培养10d后，用无菌水收集孢子并制成悬液，用载玻片萌发法试验。将孢子悬液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，在皿内滴加3～4滴无菌水保湿(100，RH)，培养24h后镜检。每个处理3个重复。
8个分离株中，C、D分离株与其它分离株之间的分生孢子萌发率差异显著(见表2)。其中G分离株的孢子平均萌发率最高，D分离株的孢子萌发率最低。
表2玫烟色拟青霉16个分离株分生子孢子萌发率(24h) 注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。
(5)分离株对烟粉虱若虫的致病力的测定 将8个分离株培养lOd后，用无菌水收集孢子，配制成浓度为107分生孢子/mL的孢子悬液。将带有2龄烟粉虱若虫的黄瓜叶片浸入悬液中，对照浸入无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为3～4片叶，每叶50～100头若虫，3次重复。摘下处理过的叶片，插于盛有无菌水的花泥中，置于透明的保鲜盒内。再置于25+0.5℃的光照培养箱中(L∶D＝14∶10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察7d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
致病力研究结果表明，所有分离株的侵染率与对照相比差异显著。8个分离株在第4d开始表现出侵染症状，从第4d的侵染率可看出E、G分离株显著高于B、C、D、F、H、1分离株，第7d时D分离株与其它分离株的侵染率差异显著。从总体而言，分离株G的致病力较强，平均为95.22％(7d)，D分离株的侵染率较低，为61.04％(7d)(表3)。
表3玫烟色拟青霉8个分离株的致病力 注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。
(6)玫烟色拟青霉分离株的筛选 在筛选优良分离株时，致病性和产孢量是重要的参考指标，孢子萌发率和菌落生长速率次之。在本发明中，菌落生长速率除C、F、I与B、G、H差异显著外，其余的分离株之间差异不显著。除C、D外其它分离株之间分生孢子萌发率差异不显著。从产孢量和致病性上看，分离株G和H较为优良，具有致病性强、产孢量高等特点(表1、表3)。综合比较各方面的因素，G分离株为最佳菌株，将其命名为PF01-N10菌株，经贵州大学刘爱英教授鉴定为玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown et Smith，其菌株保藏号CCTCC NoM207088，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。该玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus(Wize)Brown et Smith菌株PF01-N10，属丝孢目，拟青霉属。该玫烟色拟青霉菌落背面无色或黄色，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5～2μm，壁光滑，透明，大多由着生4～6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成。瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7～8×1～2μm。分生孢子柱形至梭形，光滑，透明至微淡红色，3～4×1～2μm，无厚垣孢子。
上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
实施例2玫烟色拟青霉PF01-N10菌株对烟粉虱的致病力测定 生物测定是检测虫生真菌对目标害虫的致死程度和致死速率的有效手段之一，能为综合评价该真菌的生物防治潜力提供重要的参考依据。本发明就玫烟色拟青霉PF01-N10菌株对烟粉虱的致病力进行测定，以筛选出在防治时所用的最佳浓度。
供试昆虫与寄主植物烟粉虱，将温室中饲养在黄瓜上的烟粉虱成虫，接种到无虫的黄瓜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将黄瓜幼苗置于25±0.5℃的光照培养箱中，待烟粉虱发育至2龄若虫时待用。黄瓜Cucumis sativus L.，品种为万吉青瓜，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用2～3片展开叶的盆栽苗。
(1)供试菌株的处理 经纯化后获得的玫烟色拟青霉PF01-N10菌株，采用PDA平板，于25±0.5℃的恒温箱(14L∶10D)中培养10天，加入0.3％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成1×103、1×104、1×105、1×106、1×107孢子/ml 5个浓度梯度待用。
(2)分离株对烟粉虱若虫的致病力测定 将带有烟粉虱2龄若虫的黄瓜叶片浸入6个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入含0.3％吐温-80的无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为3～4片叶，每叶50～100头若虫，3次重复。处理过的叶片连同黄瓜苗一起放置于25±0.5℃的光照培养箱中(L∶D＝14∶10)。每日镜检并记录感染死亡率，连续观察14d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
(3)玫烟色拟青霉株对烟粉虱2龄的累计死亡率 接种后的第2～3d，各处理区的若虫开始表现出发病症状，如烟粉虱的体色由透明逐渐变为白色，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现灰白色的孢子，随着孢子颜色的加深，烟粉虱死亡。表4为玫烟色拟青霉处理后2龄若虫第7d、14d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加烟粉虱2龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，烟粉虱2龄的死亡率也增加。其中1×106和1×107处理区，烟粉虱的累计死亡率差异不显著。
表4不同浓度的玫烟色拟青霉对烟粉虱2龄若虫的累计死亡率 注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。
上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
实施例3玫烟色拟青霉PF01-N10菌株对小菜蛾幼虫的致病力测定 供试昆虫与寄主植物小菜蛾，将网室中饲养在小白菜上的小菜蛾成虫，接种到无虫的小白菜幼苗上，产卵12h后，清除成虫，将小白菜幼苗置于25±0.5℃的光照培养箱中，待小菜蛾发育至2龄幼虫时待用。小白菜Brassicacampestris L.ssp.chinensis，购自广东省农科院蔬菜研究所，试验苗均采用6～8片展开叶的盆栽苗。
(1)供试菌株的处理 经纯化后获得的玫烟色拟青霉PF01-N10菌株，在PDA平板上于25±0.5℃的恒温箱(14L:10D)中培养10天，加入0.3％吐温-80的无菌水收集孢子，将孢子悬浮液在磁力搅拌器上搅拌20分钟，待孢子被打散均匀后，用医用纱布过滤去杂质，获得孢子悬浮液，用血球记数板记数确定孢子浓度后，再配成1×103、1×104、1×105、1×106、1×107孢子/ml 5个浓度梯度待用。
(2)分离株对小菜蛾幼虫的致病力测定 将带有小菜蛾2龄幼虫的小白菜叶片浸入5个梯度的孢子悬浮液中，对照浸入无菌水中，20s后取出，自然晾干。每处理为3～4片叶，每叶10头若虫，3次重复。处理过的叶片放入灭菌的托盘中(25cm×35cm)，并放置于25±0.5℃的光照培养箱中(L∶D＝14∶10)。每日镜检并记录感染死亡率，并更换新鲜的白菜叶片，连续观察10d。上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
(3)玫烟色拟青霉菌株对小菜蛾2龄的累计死亡率 接种后的第2～3d，各处理区的幼虫开始表现出发病症状，如虫体行动迟缓、食欲不振，随后可观察到虫体上有少量白色的菌丝长出，几天后虫体表面出现灰白色的孢子，随着孢子颜色的加深，烟粉虱死亡。表4为玫烟色拟青霉处理2龄幼虫后第7d、14d的累计死亡率，结果表明随着浓度的增加，小菜蛾2龄的死亡率也增加，同一浓度下随着时间的增加，小菜蛾2龄的死亡率也增加。其中1×106和1×107处理区，小菜蛾的累计死亡率差异不显著。
表4不同浓度的玫烟色拟青霉对小菜蛾2龄幼虫的累计死亡率 注表中同列数字后字母相同者表示差异不显著(DMRT法)。
上述所有试验数据均在数据处理软件SAS系统上处理完成。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种玫烟色拟青霉菌菌株，其特征在于所述菌株为玫烟色拟青霉菌PF01-N10，菌株保藏号CCTCC NoM207088，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。
2.根据权利要求1所述的一种玫烟色拟青霉菌菌株，其特征在于所述玫烟色拟青霉菌菌株属丝孢目、拟青霉属。
3.根据权利要求1所述的一种玫烟色拟青霉菌菌株，其特征在于所述玫烟色拟青霉菌菌株的菌落背面无色或黄色，分生孢子梗单生或聚集成孢梗束，100×1.5～2μm，壁光滑，透明，大多由着生4～6个瓶梗组成轮生体的轮状分枝组成，瓶梗基部球形，或拟椭圆形膨大，上部细长，5.7～8×1～2μm。分生孢子柱形至梭形，光滑，透明至微淡红色，3～4×1～2μm，无厚垣孢子。
4.权利要求1所述的一种玫烟色拟青霉菌菌株在制备防治烟粉虱、温室白粉虱、蚜虫或小菜蛾药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种玫烟色拟青霉菌菌株，该菌株是从广州地区被虫生真菌自然侵染的烟粉虱虫体上分离获得的野生菌株，将野生菌株回接于烟粉虱虫体上复壮获得玫烟色拟青霉菌菌株，对该菌株采用单孢子分离获得纯化菌株。该玫烟色拟青霉菌菌株为PF01-N10，菌株保藏号CCTCC NoM207088，2007年6月27日在中国典型培养物保藏中心保藏。经长期的侵染生物学研究和室内生物测定，玫烟色拟青霉对粉虱、蚜虫等多种刺吸式口器害虫和小菜蛾等咀嚼式口器害虫具有很强的侵染杀虫效果。
文档编号C12N1/14GK101182466SQ20071003151
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者任顺祥, 振 黄 申请人:华南农业大学