专利名称：：雨生红球藻的虾青素高产突变株的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种经选育的用以生产天然虾青素的雨生红球藻的虾青素高产突变株。
背景技术：
：虾青素(Astaxanthin)是一种暗棕红色的羰基化类胡萝卜素，其化学名为3，3'-二羟基-e，0'-胡萝卜素-4，4'-二酮，它不但具有独特的着色功能，还表现出超强的抗氧化特性和多种生物活性，被誉为自然界中最强的纯天然抗氧化维生素，其抗氧化能力是维生素E的550倍，是其他类胡萝卜素的10倍，在水产及家禽养殖、食品、化妆品、医药等领域具有广泛的应用前景，几十年来利用各种途径生产天然虾青素一直是国内外普遍关注的热点问题。目前最好的天然虾青素工业生产来源是雨生红球藻(泡6v鹏"cocciApA/w'ah'W，它是一种淡水单细胞双鞭毛绿藻，属于团藻目(KWracaJes)、衣藻科(6WaT/Jo迈o/7a^ceae)、红球藻属(Wse历aococciAS)。在国外已有几家大公司利用雨生红球藻进行天然虾青素的工业化生产，但我国天然虾青素尚未形成生产规模。全球每年对天然虫下青素的需求量仅水产市场就高达750吨左右(按纯虾青素计)，而全球每年的天然虾青素总产量不到4吨，仅为此需求量的0.5%。由于供货能力有限，天然虾青素的国际市场售价高达每吨纯品200-300万美元，每年的全球贸易金额为2亿多美元。目前这个市场仍是卖方市场，预计将会持续至少5至10年。近年来，美国、日本、澳大利亚和中国等先后开展这方面的研究工作，开发雨生红球藻生产天然虫下青素具有极大的市场前景。虽然雨生红球藻是目前最好的虾青素工业生产来源，但它生长比较缓慢，培养过程中易被其他生物污染，为了优化工业生产过程，提高虾青素的产量，需要为生产天然奸青素提供优良藻株，以提高工业产量。
发明内容本发明以雨生红球藻的野生株系为材料，采用紫外化学复合诱变，类胡萝卜素生物合成的抑制剂筛选的诱变育种方法，结果得到了一个虾青素含量高达出发株1.83倍、生长速率比出发株提高14%、生理生化特性稳定、具有稳定遗传性能的雨生红球藻优良突变株。本发明的目的就是提供一种经上述方法诱变选育而得到的雨生红球藻的虾青素高产藻株，该藻株命名为雨生红球藻(泡e鹏"cocciAs;/w/flto)El，于2007年10月19日提交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，编号为CCTCCM207164。该藻株以下简称为雨生红球藻(〃se历afococc〃s;/wv/ato)ElCCTCCM207164。所述的雨生红球藻(/fee鹏tococc"s//OTz'afo)ElCCTCCM207164具有典型的绿藻门团藻目的特征性结构。在无菌KM1培养液(1.2g/l醋酸钠、2.0g/l酵母提取液、0.4g/l天冬氨酸、0.2g/l六水氯化镁、0.01g/l七水硫酸亚铁、0.02g/l二水氯化钙，PH6.8)中、适宜条件下培养时，其营养细胞大小约5-25um，近椭圆形，绿色，活泼运动，前端略窄小，并有乳突状结构，由此结构伸出两根等长的鞭毛。细胞原生质体与细胞壁分离，在分离区具有许多辐射状的原生质束，生长快速。Hp/m^fcFlotowNIES-144野生藻株在接种后具有明显的延迟期，但泡柳a"cocciASp/wv/afcElCCTCCM207164则很快进入指数生长期。在营养生长后期，向藻液中分别加入45mM和450uM的醋酸钠和亚铁离子，并且暴露在高光强及缺氮的胁迫环境后，^ae/昭tococc"s//wv/afcElCCTCCM207164的细胞停止增殖，运动细胞迅速由绿色经黄色变成深红色最后变成红褐色。比i/.p/wWflfcFlotowNIES-144野生株更快积累色素颗粒，细胞内色素颗粒由细胞核周围向四周扩展直至占据细胞的绝大部分区域，鞭毛消失，整个细胞要比野生株细胞大而红。所述的雨生红球藻(〃ae历atococc"s;/m;/afc)ElCCTCCM207164的生理生化特征如下(1)在BBM、BG-ll等自养培养基和KM1异养培养基中均能生长，也可以混养培养。混养时生长最好。混养时最适的碳源是醋酸盐，最好的氮源是硝酸盐，最适生长光照强度为20nmolm亏1，红光比蓝光更有利于生长。较低的溶解氧有利于自养生长，而饱和的溶解氧有利于异养生长。适量的维生素(B1，1一2X10—5%，B12，4x10—7%)能改善其生长，且B1的促进效果更显著。(2)在125ixmolm—V1高光照强度、氮限制、磷或硫缺乏、盐胁迫(0.8%氯化钠)等不利环境条件下，补给醋酸钠和亚铁离子，佑记/ffaz^cocciAs;/m^fcElCCTCCM207164细胞迅速变红，积累大量虾青素和其他类胡萝卜素。虾青素含量在积累三天时就可达到细胞干重的2.54%,积累8天可达到细胞干重的3.38%，高达7/^/m'atoFlotowNIES-144野生株的1.83倍。总蛋白含量和脂肪酸含量也相应增加，碳水化合物含量高达63%。(3)绿色游动细胞中，主要色素为叶绿素a、b，叶黄素以及e—胡萝卜素。而红色厚壁孢子则积累类胡萝卜素，其组成为游离虾青素2.8%，虾青素单酯44.6%，虾青素双酯45.6%，^_胡萝卜素6.5%，玉米黄质0.35%，鸡油菌黄质0.15%。在虫下青素单酯和双酯中脂肪酸主要为C18:1。红色细胞的细胞色素f的水平不到绿色细胞的1%，大大降低，胞内的CPI、LHCI和Rubisco的水平分别只有绿色细胞的15%、48%和80%，ATP合成酶没有明显变化。而积累有次生类胡萝卜素的红色运动细胞避光反应加强。(4)在积累虾青素时，细胞最大光合速率逐渐降低，光合放氧中光合量子需要量和反应中心最小周转时间上升。在厚壁孢子的形成过程中细胞的呼吸速率上升，光合速率下降。对所述的雨生红球藻(〃aey7atococc"s//OT/ato)ElCCTCCM207164经过藻株生长速率和目标产物虾青素的诱导及提取实验，结果表明本发明的雨生红球藻(他柳afococc"sp/wv/a/&)ElCCTCCM207164，其目的产物虾青素的含量高出野生株83%，而生长状况与出发株一致，其生长速率比野生株提高14%，是一个理想的优良突变株，应用于天然虾青素的工业生产有一定的优势。因此，本发明的雨生红球藻(泡e鹏tococc〃s;/wWa/")ElCCTCCM207164是生产天然虾青素的优良藻株，可以作为工业生产来源，进行天然虾青素的工业化生产。具体实施例方式一、本发明的雨生红球藻(泡e鹏tococc"sp/m^fe)ElCCTCCM207164藻株的生长速率测定(1)培养基为KM1培养基，配方1.2g/l醋酸钠、2.0g/l酵母提取液、0.4g/l天冬氨酸、0.2g/l六水氯化镁、0.01g/l七水硫酸亚铁、0.02g/l二水氯化钙，PH6.8(2)藻种按10%的接种量，接种到含100ml无菌KM1培养基的250ml三角瓶中，在12h光暗循环、温度为22°C，光照强度为20nmolmS"的光照培养箱中静置培养，每天摇瓶三次。(3)每12h取样一次，用血球计数板进行细胞记数，根据3个平行样品的细胞数目(平均值)，绘制生长曲线，以公式"=(LnNt—LnNo)/(t—10)计算生长速率(U为比生长速率，Nt为t时间的细胞数值，No为起始细胞数值。(4)测得此突变株比生长速率为0.024±0.0018h"，比野生株提高14°/。，并且显微镜观察其生长初期细胞形态结构与野生株相似，没有延迟期，很快地进入指数生长期。诱导虾青素积累后，细胞相比野生株更快地变大变红。二、本发明的雨生红球藻(泡aws"cocc^/)/m^afo)ElCCTCCM207164藻株的目标产物虾青素的诱导及提取测定(1)在处于对数期末期的藻液中分别加入醋酸钠和亚铁离子至终浓度为45mM和450PM，同时转移到25'C、125ymolm'、—"强光照条件下持续光照静置培养，诱导虾青素产生。(2)在诱导培养3天藻液已经由绿色变为红色时，取200ml藻液，用去离子水3000g低温离心洗涤2次，去除上清，藻泥沉淀进行真空冷冻干燥处理48h，得到干藻粉。(3)称取上述干藻粉200mg，加液氮研磨，用丙酮反复提取至无色，色素提取液于4r、12000g条件下离心15分钟，收集上清，0.45pm的微孔滤膜过滤分装，-20T:冻存。在色素提取液中加入现配的含0.107M氢氧化钠的甲醇溶液，5'C皂化反应8h，将样品中的虫下青素酯分解成游离虾青素以便测定。(4)利用反相高压液相色谱法(HPLC)测定上述色素提取液及皂化反应液。色谱条件为WatersSymmetryshieldCl8柱(5|_im;4.6醒x250mm);流动相A为二氯甲烷甲醇乙腈水(5:85:5.5:4.5,v/v);流动相B为二氯甲烷甲醇乙腈水(22:28:45.5:4.5，v/v);线性梯度洗脱08min:B为0%;814min:B由0%升至100%;B维持在100%40分钟再降为0°/。；流速1.0ml/min;检测波长480nm:波长范围210700nm:进样量20^1;柱温25'C。根据各组分的色谱行为和光谱特征进行定性分析，根据不同浓度的虾青素标准品所绘制的标准曲线方程计算样品中的虾青素含量。同时也测定其他色素的含(5)上述测定结果显示本发明中雨生红球藻的虾青素高产突变株E1的虾青素及其他色素含量如下表l-表1突变株ElCCTCCM207164与出发株诱导虾青素三天时各色素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、本发明的雨生红球藻(〃ae鹏tococctAp/ww'afo)ElCCTCCM207164在扩种继代培养不同代数时其虾青素和生长速率与野生株的比较如下表2:表2突变株El纟坐代培养时虾青素和生长速率与蜀;生株的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.一种雨生红球藻的虾青素高产藻株，其特征在于该藻株是经诱变选育的雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)E1CCTCCM207164。全文摘要本发明提供一种命名为雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)E1CCTCCM207164的雨生红球藻的虾青素高产突变株，该藻株是以雨生红球藻的野生株系为材料，采用紫外化学复合诱变，类胡萝卜素生物合成的抑制剂筛选的诱变选育而得。该藻株的虾青素含量高达出发株1.83倍、生长速率比出发株提高14％、生理生化特性稳定、具有稳定遗传性能，是生产天然虾青素的优良藻株，可以作为工业生产来源，进行天然虾青素的工业化生产。文档编号C12N1/12GK101173214SQ20071003114公开日2008年5月7日申请日期2007年10月30日优先权日2007年10月30日发明者慧何,向文洲,娟彭,峰陈申请人:中国科学院南海海洋研究所