专利名称：一种新的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶、其编码序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子免疫学、分子生物学、生物信息学和基因工程等领域，具体地，本发明涉及一种马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)甘露糖脱氢酶(MDH)及其编码序列。本发明还提供了该甘露糖脱氢酶及其核酸序列的制备方法和应用。
背景技术：
真菌基因组研究始于二十世纪九十年代，第一个完成全基因组测序的真菌是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，Goffeau et al.1996)。在过去的几年里，FGI(Fungal Genome Initiative)委员会从150多万种真菌中，选取了15个在医药和工农业中具有重要价值的物种进行了基因组学的研究。2003年6月，FGI委员会新增了44个物种，其中包括了马尔尼菲青霉菌。
马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei，PM)是Capponi等首先于1956年在越南从一只中华竹鼠的肝脏分离出来的一种青霉，以其研究所主任Marneffei的名字命名。但此后并没有引起人们的注意。1973年Disalvo在美国南卡首次发现人自然感染的病例，患者是一位曾在东南亚旅行过的传教士。
1964年邓卓霖在广西一土生农民身上发现此菌，但当时全世界都还没有此病报导，故将其认定为荚膜组织胞浆菌。1984年邓卓霖在国内首例报导了一例马尔尼菲青霉病。
从1984年到1987年，广西医科大学病理科收集的19全身播散型病例中，有4例发现有导致免疫缺陷的疾病，如淋巴瘤，白血病，先天性胸腺发育不良，SLE(系统性红斑斓创)，TB(结核)等。1999年，邓卓霖首先发现了国内第一例合并AIDS的患者。近几年国内新发现的病例中，合并AIDS的患者越来越多。泰国至1998年已有1300例合并AIDS的患者。近年来发现70-80％的AIDS的患者后期感染上马尔尼菲青霉菌。
马尔尼菲青霉菌多呈条件致病菌，25℃呈丝状真菌，为非致病菌；37℃呈酵母形态，为致病菌。它是一种深部致病真菌。它侵犯人体的单核巨噬系统，破坏人的免疫系统，使人体的免疫力下降。由于它在局部的机械破坏作用，以及代谢产物，毒素等作用，产生炎症反应，导致浓肿，肉芽肿等改变。并容易破坏血管进入血液循环，导致败血症。进入人体的途径一般是呼吸道或皮肤。
甘露糖，含有六个碳原子的开环多羟基化合物，是在自然界中发现的含量最为丰富的糖类。植物、真菌、原生动物以及细菌都能够合成甘露糖，并作为碳源而储存。D-甘露糖由于不会腐蚀牙齿并可以适用于糖尿病患者广泛的应用于食品和制药工业。
通常，甘露糖脱氢酶(MDH)在NADP+作为辅助因子的条件下可逆的催化D-甘露糖和D-甘露糖-1-磷酸氧化成相应的酮类化合物D-果糖和D-果糖-1-磷酸。长链的甘露糖脱氢酶是二级醇脱氢酶，由于它广泛的应用于农业、制药业、工业，而有广泛的用途。它区别于其他的醇以及多羟基化合物，是因为它不含有保守的酪氨酸以及不依赖Zn2+以及其他的金属离子。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶(MDH)、其编码序列及该蛋白的应用。
本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的在本发明的一个方面，提供了一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码马尔尼菲青霉菌MDH的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
较佳的，所述多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
或者较佳的，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸112-912位的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv)(i)中中性功能的有义突变。
更佳的，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸112-912位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。较佳的，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
在本发明的再一方面，提供了一种载体，所述载体含上述分离出的多核苷酸。
在本发明的再一方面，提供了一种遗传工程宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。
本发明还提供了一种生产具有马尔尼菲青霉菌MDH活性的多肽的方法，该方法包括如下步骤(I)将编码具有马尔尼菲青霉菌MDH活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸112-912位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)将步骤(I)中的表达载体转入宿主细胞，形成马尔尼菲青霉菌MDH重组细胞；(III)在适合表达马尔尼菲青霉菌MDH多肽的条件下，培养步骤(II)中的重组细胞；(IV)分离出具有马尔尼菲青霉菌MDH活性的多肽。
较佳的，上述生产具有马尔尼菲青霉菌MDH活性的多肽的方法中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸112-912位的核苷酸序列。
本发明还提供了一种抗体，所述抗体是能与上述马尔尼菲青霉菌MDH特异性结合的抗体。
本发明还包括一种探针分子，该探针分子通常含有马尔尼菲青霉菌MDH的核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针分子可用于检测样品中是否存在编码马尔尼菲青霉菌MDH的核酸分子。
本发明还提供了含所述的多肽或其连续片段的药物组合物。
本发明还提供了所述的多核苷酸、多肽及抗体在制备诊断和治疗针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物及试剂盒中的应用。
本发明还提供了包含所述的多核苷酸、多肽或抗体或它们的连续片断的试剂盒及生物芯片。
本发明还包括检测马尔尼菲青霉菌MDH的核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于马尔尼菲青霉菌MDH的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
根据本发明公开的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶(MDH)在NADP+作为辅助因子的条件下可逆的催化D-甘露糖和D-甘露糖-1-磷酸氧化成相应的酮类化合物D-果糖和D-果糖-1-磷酸。长链的甘露糖脱氢酶是二级醇脱氢酶，它在农业、制药业和工业中有广泛的用途。
具体实施例方式
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。单链的DNA可以是编码链或非编码链。
在本发明中，“分离的”多核苷酸是指，该多核苷酸或片断已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该多核苷酸或片断已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
本发明中，术语“马尔尼菲青霉菌MDH的编码序列”是指编码具有马尔尼菲青霉菌MDH活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中112-912位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框112-912位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中112-912位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸112-912位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ IDNO.1中从核苷酸112-912位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与马尔尼菲青霉菌MDH相同功能的蛋白的、SEQ IDNO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“马尔尼菲青霉菌MDH”是指具有马尔尼菲青霉菌MDH活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与马尔尼菲青霉菌MDH相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括马尔尼菲青霉菌MDH的活性片断和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与马尔尼菲青霉菌MDH的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗马尔尼菲青霉菌MDH的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含马尔尼菲青霉菌MDH或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了马尔尼菲青霉菌MDH的可溶性片段。通常，该片段具有马尔尼菲青霉菌MDH多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸。
发明还提供马尔尼菲青霉菌MDH的类似物。这些类似物与天然多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞。
另一方面，本发明还包括对马尔尼菲青霉菌MDH具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。这里“特异性”是指抗体能结合于马尔尼菲青霉菌MDH或片段。较佳地，指那些能与马尔尼菲青霉菌MDH或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制马尔尼菲青霉菌MDH的分子，也包括那些并不影响MDH蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的MDH结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利NO.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的马尔尼菲青霉菌MDH或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达马尔尼菲青霉菌MDH或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断马尔尼菲青霉菌MDH的抗体以及不影响其功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用马尔尼菲青霉菌MDH的片段或功能区，通过免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与马尔尼菲青霉菌MDH的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的马尔尼菲青霉菌MDH核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，也可通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1马尔尼菲青霉菌MDH基因的克隆1.总RNA分离(Totle RNA isolation)将马尔尼菲青霉菌，在37℃或25℃培养后，离心弃上清取菌体，加入TRIzolReagents抽提其总RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。
2.mRNA的分离(mRNA isolation)用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA(Invitrogen，Carlsbad，CA)，定量。
3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)以mRNA为模板，反转录酶作用下合成双链cDNA。过柱筛选长度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，无菌水溶解，连接至pDONRTM222(Invitrogen，Carlsbad，CA)载体，以CloneMinerTMcDNA Library Construction Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行包装，电击转化，宿主菌使用DH10B(Invitrogen，Carlsbad，CA)细菌。涂板并测定滴度。
4.测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)挑选文库中有外源片段插入的克隆，扩增后抽提质粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作为3’端和5’端的通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列，传输到SUN Ultra 450Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，将无同源性或同源性低于95％的序列视为新基因建立数据库。
5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基础上，进行cDNA全长克隆，分两阶段进行(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库，将重叠序列＞50bp，同源性在98％以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag，简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接，部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜寻Genbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性，以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法，通常可获取马尔尼菲青霉菌MDH基因的全长序列。
(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长，则在已有序列的5’或3’端设计引物，在马尔尼菲青霉菌cDNA文库中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF，如无，重复上述过程直至获得全长。
(3)RT-PCR对于5’和3’端已知的序列，如果中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得，可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5’端设计引物，3’端引物采用Oligo-dT，在马尔尼菲青霉总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接并获得全长。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的马尔尼菲青霉菌MDH的全长编码序列，即获得SEQ ID NO.1所示的序列。
根据得到的全长cDNA序列推导出MDH的氨基酸序列，共266个氨基酸，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。
实施例2马尔尼菲青霉菌基因的序列信息与同源性分析本发明新的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶(MDH)基因的全长cDNA为1000bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于112-912位核苷酸。根据全长cDNA推导出马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶(MDH)的氨基酸序列，共266个氨基酸残基。详细序列见SEQ ID NO.2。将马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现在氨基酸水平上，它与支孢霉(Cladosporium fulvum)甘露糖脱氢酶(NADP-dependent mannitoldehydrogenase(EC 1.1.1.138)，SwissProt Accession No.Q96W29)的第1-266位氨基酸残基有77％的相同性和88％的相似性。由上可见，马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶基因与支孢霉甘露糖脱氢酶基因在蛋白水平上存在较高的同源性，属于同一家族并且两者在功能上也有很高相似性。
本发明的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶蛋白的N端与支孢霉甘露糖脱氢酶蛋白的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
实施例3马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶的结构和功能研究将马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶的氨基酸序列在PROSITE数据库(网址为http//expasy.hcuge.ch/sprot/scnpsitl.html)中检索基序(motif)，得到以下结果在氨基酸序列中，存在以下功能基序(i)蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)16-18，53-55，120-122，264-266(ii)酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase IIphosphorylationsite)10-13，54-57，120-123，253-256，(iii)N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)34-39，45-50，58-63，99-104，115-120，134-139而蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点均与翻译后修饰(post-translational modifications)有关，并且这些位点在药物开发过程中起着关键作用，可作为治疗由马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物的作用靶点。
实施例4马尔尼菲青霉菌MDH基因的生长发育表达谱电子Northern表达谱。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation1997 Dec 16；96(12)4146-4203)，将马尔尼菲青霉菌MDH cDNA序列在GCG软件包中的dbEST数据库中做BLAST检索，在得到的EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST，可视为该基因在不同生长发育过程中的转录表达本，由此得出表达该基因的生长发育谱，揭示它在马尔尼菲青霉菌不同发育阶段中都发挥着重要作用。
实施例5马尔尼菲青霉菌MDH的制备和提纯在该实施例中，将全长的马尔尼菲青霉菌MDH编码序列或片断构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
(1)原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌根据马尔尼菲青霉菌MDH的全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸)，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pDESTTM17载体而定)，以便构建表达载体。将马尔尼菲青霉菌MDH基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pDESTTM17载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体利用电击转化方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pDESTTM17-MDH表达载体的工程菌BL21-pDESTTM17-MDH。
(2)表达GST-MDH重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的BL21-pDESTTM17-MDH工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-MDH融合蛋白的工程菌。
(3)GST-MDH融合蛋白的提取纯化按上述方法诱导表达GST-MDH融合表达蛋白的工程菌BL21-pDESTTM17-MDH。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-MDH的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在29.6kDa处的蛋白质条带即为马尔尼菲青霉菌MDH蛋白。
实施例6马尔尼菲青霉菌MDH在酵母中进行真核细胞表达1.马尔尼菲青霉菌MDH酵母表达载体的构建及转化根据马尔尼菲青霉菌MDH的全长编码序列(SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。将马尔尼菲青霉菌MDH的cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pYES2-DEST52载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鉴定好的表达载体利用电击转化方法转入酵母细胞DB3.1中，利用氨苄青霉素筛选鉴定得到含有pYES2-DEST52-MDH表达载体的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-MDH。
2.表达MDH重组蛋白的工程菌的分离鉴定挑取单菌落的DB3.1-pYES2-DEST52-MDH工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的YPD培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养至OD600达0.5。取1ml菌液离心，在菌体沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬菌体沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量的菌株即为表达马尔尼菲青霉菌MDH融合蛋白的工程菌。
收集转化的细胞进行Western鉴定。将菌体裂解后进行SDS-PAGE电泳，电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时，而后于抗马尔尼菲青霉菌MDH的抗体溶液中封闭1小时，TBS液振摇清洗5分钟共2次，而后将膜置于生物素标记的抗马尔尼菲青霉菌MDH一抗的第二抗体溶液中振摇1小时，TBS清洗，加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟，TBS清洗2次，加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。
挑取高表达马尔尼菲青霉菌MDH的克隆。
3.马尔尼菲青霉菌MDH的提取纯化按上述方法诱导表达MDH的工程菌DB3.1-pYES2-DEST52-MDH。收集菌体沉淀，菌体沉淀加入PBS重悬菌体，超声破碎菌体，离心，清洗几次，进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在29.6kDa处的蛋白质条带即为马尔尼菲青霉菌MDH。
实施例7抗马尔尼菲青霉菌MDH抗体的制备将实施例5和实施例6中获得的马尔尼菲青霉菌MDH用层析法进行分离后备用，也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中割下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次，3-5天后用于融合。然后制备饲养细胞，再进行细胞融合。
在细胞融合10-15天后，需逐孔进行检查，一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长，就应用马尔尼菲青霉菌MDH做抗体活性的初步筛选，常用的方法有免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后，立刻进行克隆培养，并分离出抗体。
实施例8马尔尼菲青霉菌MDH基因用于制备生物芯片用获取的马尔尼菲青霉菌MDH基因的核苷酸序列设计引物，扩增出全长的马尔尼菲青霉菌MDH基因或该基因的部分片断，用作生物芯片点样的样品。
用英国的BioRobotics自动点膜仪将样品点在8×12cm尼龙膜上，每一标本点4个点，每点的DNA量约为10ng。阳性对照是重复4次点样的人β-actin基因，阴性对照是重复4次点样的λ噬菌体DNA。
含有马尔尼菲青霉菌MDH基因的芯片可用于感染马尔尼菲青霉菌疾病的诊断和药物筛选。
序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>一种新的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶、其编码序列及其应用<130>NP-1274<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1000<212>DNA<213>马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)<220>
<221>CDS<222>(112)..(912)<400>1ctgtctcgcc cttggtcttt gcaatctcat gcatccagca tcaatacctc ccgtacagag 60ccctcaatac cttactaaca ctaaacaaaa gagagagata aaaagacaaa c atg cct117Met Pro1gtc tcc gtc ccc gcc gca gac tcc ctc cac gac ctc ttc agc ctc aaa 165Val Ser Val Pro Ala Ala Asp Ser Leu His Asp Leu Phe Ser Leu Lys5 10 15ggc aag acg atc atc atc acc ggc gcc tcc ggc cct cgc ggc atg ggc 213Gly Lys Thr Ile Ile Ile Thr Gly Ala Ser Gly Pro Arg Gly Met Gly20 25 30atc gaa gca gca cgc ggc tgc gcc gag atg ggc gcc aac atc gcg ctc 261Ile Glu Ala Ala Arg Gly Cys Ala Glu Met Gly Ala Asn Ile Ala Leu35 40 45 50acc tat tct tct agg ccc gag ggc ggc gaa ata aat gcc cgc gac ctg 309Thr Tyr Ser Ser Arg Pro Glu Gly Gly Glu Ile Asn Ala Arg Asp Leu55 60 65gct aaa cag tac ggc gtc aag gct aaa gct tac aaa tgc aac gtt gcg 357Ala Lys Gln Tyr Gly Val Lys Ala Lys Ala Tyr Lys Cys Asn Val Ala70 75 80aaa tgg gag gag gtt gag aaa ttg gtg gcg gac gtg atc aag gag ttt 405Lys Trp Glu Glu Val Glu Lys Leu Val Ala Asp Val Ile Lys Glu Phe
85 90 95ggc cag atc gat ggg ttc gtg gcc aat gcc ggc cga aca gct gac aag 453Gly Gln Ile Asp Gly Phe Val Ala Asn Ala Gly Arg Thr Ala Asp Lys100 105 110ggc att ttg gaa ggt tcc gtg aag gat tgg gag gaa gtc att cag acc 501Gly Ile Leu Glu Gly Ser Val Lys Asp Trp Glu Glu Val Ile Gln Thr115 120 125 130gat ctc acg ggt acc ttc cac tgt gcc aaa gcc gtg ggc ccc cat ttc 549Asp Leu Thr Gly Thr Phe His Cys Ala Lys Ala Val Gly Pro His Phe135 140 145aag gag aga ggc aaa gga agt ttt gtc att acc gcc agc atg tcc ggc 597Lys Glu Arg Gly Lys Gly Ser Phe Val Ile Thr Ala Ser Met Ser Gly150 155 160cac att gca aat ttc cct cag gaa cag act tcg tac aac gtc gcg aaa 645His Ile Ala Asn Phe Pro Gln Glu Gln Thr Ser Tyr Asn Val Ala Lys165 170 175gca gga tgt atc cac ttt gcg cgg tcg ttg gct aac gaa tgg cgc gat 693Ala Gly Cys Ile His Phe Ala Arg Ser Leu Ala Asn Glu Trp Arg Asp180 185 190ttt gcg cgc gtc aac tcc att tca ccg ggt tat att gat acg ggt ctg 741Phe Ala Arg Val Asn Ser Ile Ser Pro Gly Tyr Ile Asp Thr Gly Leu195 200 205 210tcg gac ttt gtg ccg caa aaa att cag gat ttg tgg aat tcg atg atc 789Ser Asp Phe Val Pro Gln Lys Ile Gln Asp Leu Trp Asn Ser Met Ile215 220 225cct ctg gga cgc aac gga cat gca aag gag ctc aag ggg gcg tac gtg 837Pro Leu Gly Arg Asn Gly His Ala Lys Glu Leu Lys Gly Ala Tyr Val230 235 240tac ctg ctc agc gat gcg agt acg tat acc acg ggt gcg gat att gtg 885Tyr Leu Leu Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ala Asp Ile Val245 250 255att gat gga ggg tat act gtg cga taa gcctttattt taactaatta 932Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Val Arg260 265cggagtacta cgaagtagca taccttctat aattctcgtg atatgaaaaa aaaaaaaaaa 992aaaaaaaa1000
<210>2<211>266<212>PRT<213>马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)<400>2Met Pro Val Ser Val Pro Ala Ala Asp Ser Leu His Asp Leu Phe Ser1 5 10 15Leu Lys Gly Lys Thr Ile Ile Ile Thr Gly Ala Ser Gly Pro Arg Gly20 25 30Met Gly Ile Glu Ala Ala Arg Gly Cys Ala Glu Met Gly Ala Asn Ile35 40 45Ala Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Pro Glu Gly Gly Glu Ile Asn Ala Arg50 55 60Asp Leu Ala Lys Gln Tyr Gly Val Lys Ala Lys Ala Tyr Lys Cys Asn65 70 75 80Val Ala Lys Trp Glu Glu Val Glu Lys Leu Val Ala Asp Val Ile Lys85 90 95Glu Phe Gly Gln Ile Asp Gly Phe Val Ala Asn Ala Gly Arg Thr Ala100 105 110Asp Lys Gly Ile Leu Glu Gly Ser Val Lys Asp Trp Glu Glu Val Ile115 120 125Gln Thr Asp Leu Thr Gly Thr Phe His Cys Ala Lys Ala Val Gly Pro130 135 140His Phe Lys Glu Arg Gly Lys Gly Ser Phe Val Ile Thr Ala Ser Met145 150 155 160Ser Gly His Ile Ala Asn Phe Pro Gln Glu Gln Thr Ser Tyr Asn Val165 170 175
Ala Lys Ala Gly Cys Ile His Phe Ala Arg Ser Leu Ala Asn Glu Trp180 185 190Arg Asp Phe Ala Arg Val Asn Ser Ile Ser Pro Gly Tyr Ile Asp Thr195 200 205Gly Leu Ser Asp Phe Val Pro Gln Lys Ile Gln Asp Leu Trp Asn Ser210 215 220Met Ile Pro Leu Gly Arg Asn Gly His Ala Lys Glu Leu Lys Gly Ala225 230 235 240Tyr Val Tyr Leu Leu Ser Asp Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Gly Ala Asp245 250 255Ile Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Val Arg260 26权利要求
1.一种来自马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)的分离的多核苷酸，其含有编码马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶的多核苷酸序列，所述多核苷酸选自a)与编码含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸有至少70％同源性的多核苷酸，b)编码含有与SEQ ID NO.2的氨基酸序列至少70％同源性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2.如权利要求1所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如权利要求1所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有(i)如SEQ ID NO.1中核苷酸112-912位的核苷酸序列，或(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地(iv)(i)中中性功能的有义突变。
4.如权利要求3所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸含有SEQ ID NO.1中核苷酸112-912位的核苷酸序列。
5.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列或其片段。
6.如权利要求5所述的一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽是含有SEQID NO.2所示氨基酸序列的多肽。
7.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的分离的多核苷酸。
8.一种遗传工程宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是用权利要求7所述载体转化的宿主细胞。
9.一种生产具有马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(I)将编码具有马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸112-912位的核苷酸序列有至少70％同源性；(II)将步骤(I)中的表达载体转入宿主细胞，形成马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶重组细胞；(III)在适合表达马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶多肽的条件下，培养步骤(II)中的重组细胞；(IV)分离出具有马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶活性的多肽。
10.如权利要求9所述的一种生产具有马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶活性的多肽的方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸112-912位的核苷酸序列。
11.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求5或6所述的多肽特异性结合的抗体。
12.一种探针分子，其特征在于，所述的探针分子含有权利要求1所述的多核苷酸中8-100个连续的核苷酸。
13.权利要求5或6的多肽在制备治疗针对马尔尼菲青霉菌引起的疾病的药物中的应用。
14.含有权利要求5或6的多肽的药物组合物。
15.一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含权利要求1～4中任一种多核苷酸序列或其连续片段，或者所述试剂盒包含权利要求5或6的多肽或其连续片段，或者所述试剂盒包含权利要求11的抗体。
16.一种生物芯片，其特征在于所述生物芯片的载体上含有权利要求1～4中任一种多核苷酸序列或其连续片段，或者所述生物芯片的载体上含有权利要求5或6的多肽或其连续片段，或者所述生物芯片的载体上包含权利要求11的抗体。
全文摘要
本发明提供了一种在马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)中表达的新的马尔尼菲青霉菌甘露糖脱氢酶(MDH)及其编码序列，本发明还提供了该蛋白及其核酸的制备方法及其应用。甘露糖脱氢酶(MDH)在NADP+作为辅助因子的条件下可逆的催化D－甘露糖和D－甘露糖－1－磷酸氧化成相应的酮类化合物D－果糖和D－果糖－1－磷酸。长链的甘露糖脱氢酶是二级醇脱氢酶，它在农业、制药业和工业中有广泛的用途。
文档编号C12N15/53GK1690208SQ20041001798
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月28日 优先权日2004年4月28日
发明者任双喜, 汤生荣, 卜云萍, 殷世亮, 严中华, 卢凌峰, 施炜亮, 武金炜, 李运千 申请人:上海人类基因组研究中心