专利名称：乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。
背景技术：
酒精滥用和酒精依赖已成为当今世界上日益严重的公共卫生问题，特别是青少年饮酒更值得人们重视。酒精性肝病过去在我国较少见，因此对其研究亦是不多，但近年来酒精性肝病的发病率明显增加，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。酒精对肝脏有明显的毒性作用，重度饮酒精者中80％以上有一定程度的脂肪肝，10％-35％可发展成酒精性肝炎，10％-20％将发展为肝硬化。
酒精(乙醇)在体内代谢转化为乙醛和乙酸，主要为乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)作用。ADH有3种不同基因编码的同工酶ADH1(α)、ADH2(β)、ADH3(γ)，基中ADH2和ADH3存在一定的多态性，ADH2有三个等位基因位点，ADH2*1、ADH2*2和ADH2*3，分别编码β1、β2和β3三个亚单位，ADH2等位基因的多态性是由于47(GψA)和369(CψT)密码子的单一碱基置换，β1的同功酶对酒精具有低Km(0.049mmol/L)和低的最大清除率(Vmax)(0.23U/min)，β2.的同功酶比较具有低Km(0.94mmol/L)最大清除率(8.6U/min)，同功酶β3具有对酒精高Km(36mmol/L)和高Vmax(7.9U/min)。ADH3*1表达产物的活性是ADH3*2的2倍。ALDH2基因编码有活性和无活性的亚单位的等位基因分别被命名为ALDH2*1和ALDH2*2，这些同功酶的不同在于487密码子的碱基互换(GψA)，产生赖氨酸(无活性亚单位)和谷氨酸(活性亚单位)的互换。乙醇代谢酶相关基因的多态性在酒精性肝病以及其他代谢和药物性肝病的发病中有重要作用。
用于SNPs做基因分析是特指检测人类基因组中大量存在的单核苷酸变异，这与疾病易感性和毒物易感性有关[1]。SNPs不仅是人类种族和个体差异的标记，亦是决定不同人群种族和个体差异的标记，可以成为寻找疾病相关基因，进行疾病诊断、预防和药物筛选的基础。用于SNPs检测的常规方法有等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交，限制性内切酶法(RFLP)，位点特异性引物PCR(PCR-SSP)和直接测序等。基因芯片技术的发展为新的SNPs的检测方法提供了可能性[2]。寡核苷酸芯片技术是新近发展起来的一种基因检测技术，它可将大量的寡核苷酸探针有规律地排列在一张玻片上，这些探针可以与信号显示物质标记的样品DNA的扩增序列的互补序列进行相结合，通过对信号物质进行检测，对杂交结果进行计算机软件处理分析，从而获得杂交信号的强度及其分布模式图。
参考文献[1]Khner M K，Beerli P，Yamato J，et al.Usefulness of single nucleatide polymorphismdata for estimating population parameters.Genetics，2000，156439-447[2]Hirschlhorn J N，Sklar P，Lindblad-Toh K，et al.SBE-TAGSan array-based methodfor efficient single-nucleotide polymorphism genotyping.Proc Natl Acad SciUSA，2000，9712164-12169[3]Picoult-Newberg L，Idker TE，Pohl M G，et al.Mining SNPs from ESTdatabases.Genome Res，1999，9167-174. 虞朝辉 陈李华，陈卫星等.醇代谢相关酶寡聚核苷酸基因芯片的制备和应用.中华消化杂志2003，23(11)；695-6发明内容本发明的目的是提供一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。
乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片在载体上设有如下探针ADH3 5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA TAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA AAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA GAT TTG TTATADH2(等位基因1和等位基因2)5’-AAT CTG TCG CAC AGA TG5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAT CTG TCC CAC AGA TG5’-AAT CTG TCT CAC AGA TGADH2(等位基因1和等位基因3)5’-GCA GTA TCT GTA CCG TC5’-GCA GTA TCC GTA CCG TC5’-GCA GTA TCA GTA CCG TC5’-GCA GTA TCG GTA CCG TCALDH2 5’-CAT ACA CTG AAG TGA AA5’-CAT ACA CTA AAG TGA AA
5’-CAT ACA CTT AAG TGA AA5’-CAT ACA CTC AAG TGA AA乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片制备方法步骤为1)芯片载体的处理载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，24～26％氨水中过夜，水洗，玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节PH至4～4.5，95％乙醇超声清洗，150～160℃烘干3～5小时，9～11％戊二醛处理成醛基化；2)引物及探针的合成针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计了一套探针(如表1)，针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计合成了4对引物(如表2)，每对引物中各有一条Cyp-3信号分子标记，合成后用浓氨水75～85℃脱保护，切割14～17小时，OPC柱纯化，紫外定量后真空干燥浓缩，-20～-80℃保存备用；3)基因芯片制备及后处理寡核苷酸探针以15μM的浓度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制备仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，点间距为0.5mm。点样完毕后，室温放置过夜。
乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片用于酒精性肝病患者乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的多态性检测和分型。
本发明将经过选择的探针点样于玻片上，分别与经PCR扩增的乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的DNA片段进行杂交，一次性获得各位点的多态情况，从而实现对乙醇代谢酶相关基因多态性进行快速、简捷、高通量检测和分型，具有重要的社会和经济效益。
具体实施例方式
本发明玻片上固相化的探针为寡核苷酸探针，其序列根据乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因特征设计，起长度范围在15-20个碱基，一般为18个碱基，其Tm值基本一致，在40～43℃。
所说引物是根据乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因特征设计，引物序列长度在20-24个碱基之间，分别用于上述基因的扩增。
信号分子标记是针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因序列扩增的引物。信号分子标记是荧光分子。
表1乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的探针
表2乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的引物
实施例1核苷酸基因芯片的制备1)芯片载体的处理载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，25％氨水中过夜，水洗。玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节PH至4.5，95％乙醇超声清洗，160℃烘干4小时，5％戊二醛处理成醛基化。
2)引物及探针的合成本发明针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计了一套探针(见表1)。针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计合成了4对引物(见表2)。每对引物中各有一条Cyp-3荧光标记。合成后用浓氨水80℃脱保护，切割15小时，OPC柱纯化。紫外定量后真空干燥浓缩，-20℃保存备用。
3)基因芯片制备及后处理寡核苷酸探针以15μM的浓度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制备仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，点间距为0.5mm。点样完毕后，室温放置过夜。
实施例2核苷酸基因芯片的制备1)芯片载体的处理载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，24％氨水中过夜，水洗，玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节PH至4，95％乙醇超声清洗，150℃烘干3小时，9％戊二醛处理成醛基化；2)引物及探针的合成针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计了一套探针，针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计合成了4对引物，每对引物中各有一条Cyp-3信号分子标记，合成后用浓氨水75℃脱保护，切割13小时，OPC柱纯化，紫外定量后真空干燥浓缩，-20℃保存备用；3)基因芯片制备及后处理寡核苷酸探针以15μM的浓度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制备仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，点间距为0.5mm。点样完毕后，室温放置过夜。
实施例3核苷酸基因芯片的制备
1)芯片载体的处理载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，26％氨水中过夜，水洗，玻璃片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节PH至4.5，95％乙醇超声清洗，160℃烘干5小时，11％戊二醛处理成醛基化；2)引物及探针的合成针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计了一套探针，针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计合成了4对引物，每对引物中各有一条Cyp-3信号分子标记，合成后用浓氨水85℃脱保护，切割17小时，OPC柱纯化，紫外定量后真空干燥浓缩，一80℃保存备用；3)基因芯片制备及后处理寡核苷酸探针以15μM的浓度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制备仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，点间距为0.5mm。点样完毕后，室温放置过夜。
乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的使用方法为1)载有寡核苷酸探针的玻片使用前0.2％SDS和清水各洗两次，空气干燥后1％NaBH4溶液还原10min，0.2％SDS洗一次，水洗一次，空气干燥后用待用，完成将探针共价固相化于玻片表面。
2)20ul PCR反应体系中含有50ng DNA、4对引物(表2)，10mM Tris-HClpH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl2，200uM dNTP，以及1.5单位Taq酶；其中引物含量为20ng Cyp-3荧光标记引物，2ng普通引物。PCR循环条件5分钟95℃变性；35循环的各45秒的94℃变性，57.5℃退火，72℃延伸；最后为5分钟72℃延伸。
3)2ulPCR产物与10ul杂交缓冲液混合后，与制备好的寡核苷酸探针玻片在42℃杂交1小时，然后分别用1×SSC、0.2％SDS，0.2×SSC，0.1×SSC清洗，最后用激光共聚焦荧光扫描仪ScanArray 3000检测，在85％激光强度下扫描3遍。分析阳性探针组成，判断乙醇代谢相关酶的基因多态性的判别。乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片使用实例对165例嗜酒者，其中无肝脏损害的43例，酒精性肝病122例，年龄25～70岁，平均44.0岁。正常对照组65例，年龄26～68岁，平均45.9岁。所有研究对象均来自浙江省酒精性肝病流行病学调查人群。诊断标准参照“酒精性肝病的诊断依据及治愈、好转标准[3]”，并排除乙型病毒性肝炎表面抗原和丙型病毒性肝炎抗体阳性着，不典型者做肝穿刺活检。所有对象均抽取3ml外周血，按常规提取DNA用上述芯片上述方法检测。结果为1)ADH2基因的多态性健康对照组、嗜酒者组、无肝脏损害组和酒精性肝病组的ADH2*1等位基因频率分别为37.69％、55.76％、46.51％、59.02％；ADH2*2等位基因频率分别为62.31％、44.24％、53.49％、40.98％；未发现ADH2*3等位基因。嗜酒者和酒精性肝病患者的ADH2*1频率明显高于健康对照组，酒精性肝病患者高于无肝脏损害的嗜酒者；2)ADH3基因多态性嗜酒者和酒精性肝病的ADH3基因的等位基因频率与健康对照组比较，无肝脏损害的嗜酒者的ADH3*2频率高于健康对照。3)ALDH2基因多态性嗜酒者和酒精性肝病患者的ALDH2*2等位基因频率低于健康对照组，酒精性肝病患者ALDH2*2等位基因频率显著低于无肝脏损害的嗜酒者[4]。
权利要求
1.一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片，其特征在于在载体上设有如下探针ADH3 5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA TAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA AAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA GAT TTG TTATADH2(等位基因1和等位基因2)5’-AAT CTG TCG CAC AGA TG`5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAT CTG TCC CAC AGA TG5’-AAT CTG TCT CAC AGA TGADH2(等位基因1和等位基因3)5’-GCA GTA TCT GTA CCG TC5’-GCA GTA TCC GTA CCG TC5’-GCA GTA TCA GTA CCG TC5’-GCA GTA TCG GTA CCG TCALDH2 5’-CAT ACA CTG AAG TGA AA5’-CAT ACA CTA AAG TGA AA5’-CAT ACA CTT AAG TGA AA5’-CAT ACA CTC AAG TGA AA
2.根据权利要求1所述的一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片，其特征在于所说的载体为玻片。
3.一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的制备方法，其特征在于方法步骤为1)芯片载体的处理载波片用铬酸洗液浸泡过夜，水洗，24～26％氨水中过夜，水洗，玻片浸入氨丙基三甲氧基硅烷的95％乙醇溶液中，用冰醋酸调节PH至4～4.5，95％乙醇超声清洗，150～160℃烘干3～5小时，9～11％戊二醛处理成醛基化；2)引物及探针的合成针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计了一套探针，针对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2基因设计合成了4对引物，每对引物中各有一条Cyp-3信号分子标记，合成后用浓氨水75～85℃脱保护，切割13～17小时，OPC柱纯化，紫外定量后真空干燥浓缩，-20～-80℃保存备用；3)基因芯片制备及后处理寡核苷酸探针以15μM的浓度溶解在3×SSC溶液中，用PixySys5500芯片制备仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，点间距为0.5mm。点样完毕后，室温放置过夜固相化，即可。
4.根据权利要求3所述的一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的制备方法，其特征在于所说玻片上固相化的探针为寡核苷酸探针，其序列根据乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因特征设计，它的长度范围在15-20个碱基，其Tm值为40～43℃。
5.根据权利要求3所述的一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的制备方法，其特征在于所说的探针是ADH3 5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA TAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA AAT TTG TTAT5’-AAG GTA AAA GAT TTG TTATADH2(等位基因1和等位基因2)5’-AAT CTG TCG CAC AGA TG5’-AAG GTA AAA CAT TTG TTAT5’-AAT CTG TCC CAC AGA TG5’-AAT CTG TCT CAC AGA TGADH2(等位基因1和等位基因3)5’-GCA GTA TCT GTA CCG TC5’-GCA GTA TCC GTA CCG TC5’-GCA GTA TCA GTA CCG TC5’-GCA GTA TCG GTA CCG TCALDH2 5’-CAT ACA CTG AAG TGA AA5’-CAT ACA CTA AAG TGA AA5’-CAT ACA CTT AAG TGA AA5’-CAT ACA CTC AAG TGA AA
6.根据权利要求3所述的一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的制备方法，其特征在于所说引物是根一据乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的基因特征设计，引物序列长度在20-24个碱基之间，分别用于上述基因的扩增。
7.根据权利要求3所述的一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的制备方法，其特征在于所说的引物为基因 Cyp-3荧光标记引物 引物ADH3 5’-CTT TAA GAG TAA AGA ATC TGT CC-3’5’-ACC TCT TTC CAGAGC GAA GCAG-3’ADH2 5’-GAA GGG GGG TCA CCA GGT TGC-3’ 5’-AAT CTT TTC TGAATC TGA ACAG-3’(等位基因1和等位基因2)ADH2 5’-TTG ATA ACA TCT CTG AAG AGC TGA-3’ 5’-TGG ACT CTC ACAACA AGC ATGT-3’(等位基因1和等位基因3)ALDH2 5’-CAG GTC CCA CAC TCA CAG TTT-3’ 5’-CAC CCT TTG GTGGCT ACA AG-3’
8.根据权利要求3所述的的一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的制备方法，其特征在于所说的信号分子标记是荧光分子。
9.一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片的用途，其特征在于用于酒精性肝病患者乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2的多态性检测和分型。
全文摘要
本发明公开了一种乙醇代谢相关酶基因多态性检测芯片及其制备方法和用途。在载体上设有如下探针ADH35’－AAG GTA AAA CAT TTG TTAT 5’－AAG GTA AAA TAT TTG TTAT 5’－AAG GTA AAA AAT TTG TTAT 5’－AAG GTA AAA GAT TTG TTATA DH2(等位基因1和等位基因2)5’－AAT CTG TCG CAC AGA TG 5’－AAG GTA AAA CAT TTG TTAT 5’－AAT CTG TCC CAC AGA TG 5’－AAT CTG TCT CAC AGA TGA DH2(等位基因1和等位基因3)5’－GCA GTA TCT GTA CCG TC 5’－GCA GTA TCC GTA CCG TC 5’－GCA GTA TCA GTA CCG TC 5’－GCA GTA TCG GTA CCG TC ALDH2 5’－CAT ACA CTG AAG TGA AA 5’－CAT ACA CTA AAG TGA AA 5’－CAT ACA CTT AAG TGA AA 5’－CAT ACA CTC AAG TGA AA。本发明的优点是实施实现了对乙醇代谢酶相关基因ADH2、ADH3和ALDH2多态性快速、简捷、高通量检测，具有重要的社会和经济效益。
文档编号C12Q1/68GK1563421SQ20041001794
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月21日 优先权日2004年4月21日
发明者厉有名, 虞朝辉 申请人:浙江大学