一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜中的应用。本发明所提供的dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组成的双链RNA。实验证明，饲喂谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA后，麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦长管蚜的细胞内发生了RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看，麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数和存活率均比对照显著降低。这表明谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本发明为下一步利用植物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。
【专利说明】一种谷胱甘肽-S-转移酶基因dsRNA及其在防治麦长管蚜 中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种谷胱甘肽-S-转移酶基因 dsRNA及其在防治 麦长管蚜中的应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是我国的主要粮食作物。小麦田内害虫种类很多，主要害虫有地下害虫、小 麦吸浆虫、麦蚜、麦蜘蛛、食叶的粘虫等，其中麦蚜对小麦的危害最为严重。麦蚜属同翅目 蚜科，俗称腻虫、由汗、蜜虫等，是我国小麦上的主要害虫之一。其种类主要包括麦长管蚜 (Sitobion avenae)、麦二叉虫牙（Schizaphis graminum)、禾谷溢管虫牙（Rhopalosiphum padi Linnaeus)、麦无网长管姆（Acyrthosiphon dirhodum)等。麦长管姆、麦二叉姆和禾谷纟益管 蚜在世界各个地区广泛分布，我国小麦种植区内均有发生。麦二叉蚜主要分布在西北、华北 地区，麦长管蚜危害南北麦区，禾谷缢管蚜在南方地区发生严重。麦蚜的发生受气候影响较 大，在小麦生不同的生长期内，麦蚜的危害优势种有所不同，在小麦拔节期，麦二叉蚜种群 密度大，到达抽穗期，麦长管蚜逐渐变为优势种，麦二叉蚜与麦长管蚜混合发生，小麦抽穗 以后，禾谷缢管蚜发生严重。
[0003] 麦蚜以若蚜、成蚜聚集在小麦叶片、茎干，吸食小麦汁液，造成小麦叶片出现黄斑 或枯萎，在苗期危害严重时造成小麦苗枯死，后期危害穗部，造成小麦籽粒干瘪，使小麦品 质变劣，产量降低。麦蚜排出的废物覆盖在叶片上使叶片变黑，光合作用受到严重影响。此 夕卜，麦姆还分泌毒素，传播病害，严重影响小麦产量和品质。因麦姆的危害造成小麦减产一 般在10% -20%，麦蚜危害严重时小麦减产量达到30%。麦蚜还可以传播小麦与大麦黄矮 病毒，使小麦产量降低。
[0004] RNAi的基本过程包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，dsRNA穿过细胞膜进入 细胞后，细胞质中的一种RNA酶III家族的内切酶Dicer酶特异识别dsRNA，Dicer酶将dsRNA 切割成许多 21bp_23bp 的小片段（small interference RNA，siRNA)，每个 siRNA 都有 2 个突出的核苷酸。效应阶段，siRNA与一个酶复合物形成一种沉默复合物（RNA-indueed sileneeing eomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，携带的双链siRNA被RISC变成单链 siRNA分子，变成具有活性的RlSC(Slicer)。之后Slicer与外源性基因表达的mRNA分子结 合，RISC在结合部位开始切割mRNA。切割后的mRNA诱导细胞降解这些mRNA片段。siRNA还 能引导目的RNA结合RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)，合成新的 dsRNA， 然后由Dicer酶切割产生新的siRNA，又引发新一轮的合成切割过程，沉默信号逐渐扩大。
[0005] 目前常用的dsRNA导入的方法有注射法、浸泡法、饲喂法、组织培养法、植物介导 法等。注射法是通过显微注射仪将dsRNA导入到昆虫体内，是目前最常用的方法。这种方 法既有优点又有缺点，优点是效率高，缺点是体外合成保存dsRNA成本高，难以避免注射的 伤口影响昆虫生长。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆虫组织或细胞，可以有效地抑制基因表 达。浸泡法有一定的局限性，只适合于昆虫一定的发育阶段和易吸收dsRNA的细胞组织， 在研究中应用较少。饲喂法操作方便且简单，对昆虫的影响小。喂食dsRNA在许多昆虫中 都取得了成功，例如半翅目、鳞翅目、鞘翅目昆虫。组织培养法将dsRNA混入培养基，昆虫 细胞从培养基里吸收dsRNA。目前利用这种方法取得成功的昆虫有果蝇、埃及伊蚊、白纹伊 蚊。这种方法要求的培养基条件严格，不容易培养得到符合要求的细胞，对这种方法的使用 受一定限制。转基因植物介导法是借助植物持续不断的产生稳定的dsRNA，昆虫持续取食 这种植物会不断的摄入dsRNA。但是这种方法也有一定的局限性，不同昆虫或同一昆虫的 不同基因对通过口腔进入的RNAi的敏感性不同，影响喂食dsRNA的成功率的关键因素是昆 虫的上皮细胞摄入dsRNA的效率。Walshe等发现利用喂食方法可以抑制刺舌蝇（Glossina morsitans morsitans)中肠表达TsetseEP，却不能抑制脂肪体的传递蛋白基因2A192的表 达。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种谷胱甘肽-S-转移酶基因（GST基因）dsRNA及其在防治 麦长管蚜中的应用。
[0007] 本发明所提供的dsRNA，具体为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序 列所示的核苷酸组成的双链RNA。
[0008] 编码所述dsRNA的DNA分子也属于本发明的保护范围。
[0009] 所述DNA分子的核苷酸序列具体为序列表中序列2。
[0010] 含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系也属于本发明 的保护范围。
[0011] 所述dsRNA、或所述DNA分子、或所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞 系，在如下（al)_(a5)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
[0012] (al)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；
[0013] (a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；
[0014] (a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；
[0015] (a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品；
[0016] (a5)抑制麦长管姆谷胱甘肽-S-转移酶基因表达或制备抑制麦长管姆谷胱甘 肽-s-转移酶基因表达的产品。
[0017] 进一步，所述应用为将所述dsRNA导入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、降 低麦长管蚜存活率、抑制麦长管蚜生长、降低麦长管蚜蜕皮指数或抑制麦长管蚜谷胱甘 肽-S-转移酶基因表达。
[0018] 在本发明中，所述导入的方式具体为饲喂。
[0019] 更加具体的，所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲料中，得到混合液；用所述 混合液饲喂麦长管蚜；所述dsRNA在所述混合液中的终浓度具体为5-20ng/μ L (如20ng/ μ L)。
[0020] 所述饲喂持续的时间可为5天以上，具体如5-6天。
[0021] 在本发明中，所述麦长管蚜具体为若虫期麦长管蚜，具体如2龄麦长管蚜。
[0022] 活性成分为如下A-C中任一种的产品也属于本发明的保护范围：
[0023] A、所述 dsRNA;
[0024] B、所述DNA分子；
[0025] C、所述表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系；
[0026] 所述产品具有如下（al)-(a5)功能中的至少一种：
[0027] (al)防治麦长管蚜；
[0028] (a2)降低麦长管蚜存活率；
[0029] (a3)抑制麦长管蚜生长；
[0030] (a4)降低麦长管蚜蜕皮指数；
[0031] (a5)抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达。
[0032] 另外，抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达的物质，在如下（al)_(a4)任一 中的应用同样属于本发明的保护范围：
[0033] (al)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品；
[0034] (a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品；
[0035] (a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品；
[0036] (a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品。
[0037] 本发明将麦长管蚜GST基因 dsRNA(序列1)采用体外饲喂的方法饲喂麦长管蚜， 实际上是利用RNAi技术对GST基因的表达进行干扰。结果显示，从mRNA水平上检测饲喂 后的麦长管蚜GST基因有不同程度的降低，说明麦长管蚜通过口针摄入的dsRNA进入了麦 长管蚜的细胞内发生了 RNAi级联反应，目的基因的表达受到了干扰。在形态学角度来看， 麦长管蚜的生长状态均发生了变化，饲喂GST基因 dsRNA的麦长管蚜的蜕皮指数和存活率 均比对照降低。这表明GST基因 dsRNA可以用于麦长管蚜的防治，本发明为下一步利用植 物介导的RNAi技术创建小麦新种质奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1为麦长管蚜总RNA的提取结果。
[0039] 图2为麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因（GST基因）cDNA片段的PCR扩增。Μ为 标准DNA marker ; 1为GST基因。
[0040] 图3为体外转录所得麦长管蚜GST基因 dsRNA和GFP基因 dsRNA的琼脂糖凝胶电 泳结果。M :D2000plus ;1 :麦长管蚜GST基因体外转录产物dsRNA ;2 :GFP基因体外转录产 物dsRNA ;可以看到，得到目的转录产物。
[0041] 图4为不同龄期麦长管蚜GST基因的表达量分析。其中，L1-L4为1-4龄麦长管 虫牙幼虫，Adult为麦长管虫牙成虫。图中，*表示P〈0. 05, **表示P〈0. 01。
[0042] 图5为不同浓度的dsGST饲喂麦长管蚜后GST基因的表达水平分析。图中，*表 示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0043] 图6为饲喂dsGST后不同处理组中麦长管蚜的存活率统计。图中，*表示Ρ〈0. 05， ** 表示 Ρ〈〇· 01。
[0044] 图7为饲喂dsGST 6天后不同处理组中麦长管蚜的蜕皮指数统计。图中，*表示 Ρ〈0· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
[0045] 图8为饲喂dsGST 6天后不同处理组中麦长管蚜GST基因的表达水平分析。图中， * 表示 Ρ〈〇· 05, ** 表示 Ρ〈0· 01。
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 麦长管姆（Sitobion avenae):从中国农业大学上庄实验站小麦试验田获得，按 照"王春芝，3种小麦蚜虫的形态识别与防治技术，农技服务，2008, 25(3) :50, 58" 一文记载 的方法，鉴定证实确为麦长管姆（Sitobion avenae)。其形态学特征如下：无翅孤雌姆体长 3. 1mm，宽1.4mm，长卵形，草绿色至橙红色，有时头部带红色或褐色，腹部两侧有不明显的灰 绿至灰黑色斑。触角黑色，第3节有8 -12个感觉圈排成一行。腹部第6-8节及腹面具横网 纹，无缘瘤。喙粗大，黑色，长度超过中足基节。腹管长圆筒形，黑色，长为体长的1/4,在端部 有十几行网纹。有翅孤雌蚜体长3. 0_，椭圆形，绿色。喙不达中足基节。腹管长圆筒形，黑 色，端部具15?16行横行网纹，尾片长圆锥状，有8?9根毛。若蚜体绿色，有时粉红色，复 眼红色，一般体较短。麦长管姆的饲养条件是：温度（22±1)°C，光周期16L : 8D，相对湿度 控制在85 % -90 %。用温水浸泡小麦种子4h-8h，然后将小麦种子种在直径8cm，高为12cm 的花盆中，放在人工气候培养箱中培养（温度22±1°C，光周期16L : 8D，RH85%-90%)。 待5天后，小麦叶片长出约5cm时在小麦上接蚜虫。
[0049] pEGAD质粒：GenBank N0:AF218816. 1，购于美国俄亥俄州立大学。在文献"Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency^ Proc Natl Acad Sci USA. 97 (7), 3718-3723 (2000) 中报道过。
[0050] 总 RNA 提取试剂 TRIzol，FastQuant RT Kit(With gDNase)，PCR 产物纯化试剂盒， 质粒小提试剂盒、突光定量试剂RealMasterMix(SYBR Green)均购自天根生化科技（北京） 有限公司。T 载体 pMD19_T Simple Vector、Ex Taq?购自 TaKaRa。T7RiboMAX expression RNAisystem购自promega。2XTaqMasterMix购自北京艾德莱生物科技有限公司。乙醇、 异丙醇均为国产试剂。
[0051] 麦长管蚜的人工饲料：制备过程可参考文献"李彩霞，高丽锋，高玲玲，李 润植.全纯人工营养液饲养蚜虫的研究.山西农业大学学报，1997, 17(3) :225-228. Li C X, Gao L F, Gao L L, Li R Z. Study on the rearing of aphids on a artificially holidic diets. Journal of Shanxi Agricultural University, 1997, 17(3):225-228. (in Chinese) "进行，用0. 2 μ m的细菌过滤器过滤人工饲料，分装到2. OmL灭菌的离心管保存 于-20°C的冰箱中，避免反复冻融。
[0052] 实施例1、麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因 dsRNA的获得
[0053] -、麦长管蚜总RNA的提取及反转录
[0054] 1、总 RNA 提取
[0055] 1)取50头麦长管姆放入无 RNA酶的1. 5mL EP离心管中，加入60 μ LTrizol Reagent,用电动研磨器研磨至勻楽状态；
[0056] 2)取出1-2 μ L总RNA进行1. 5 %琼脂糖凝胶电泳检测，同时用NanoDrop测定 260/280吸光值、260/230吸光值和核酸浓度，剩余的放于-80°C备用。
[0057] 结果如图1所示，可见提取的总RNA比较完整，总RNA的5S、18S、28S条带比较清 晰，RNA未降解。
[0058] 2、反转录
[0059] 按反转录试剂盒进行操作，操作如下：
[0060] (1)配制基因组 DNA 去除体系混合液：5 X gDNA buffer 2 μ 1 ;总 RNA1 μ g ;RNase free ddH20 补足 10 μ 1。
[0061] 42°C孵育3min，冰上放置。
[0062] (2)配制反转录反应体系混合液：RT Enzyme Mix 1 μ 1 ;10XFast RT buffer 2μ 1 ;FQ_RT Primer Mix 2μ 1 ;RNasefree ddH20 补足 10μ 1。
[0063] (3)将步骤⑴配得的混合液加入步骤⑵中配得的混合液中，充分混勻。42°C孵 育15min之后95°C孵育3min。将反转录后得到的cDNA存放于-20°C保存。
[0064] 二、含有麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因片段的重组质粒的构建
[0065] 根据豌豆蚜的谷胱甘肽-S-转移酶基因（GST基因）（GenBank登录号： NM_001162802. 2)序列设计引物，引物如下：
[0066] 引物 GSTF :5' -ACGGTGAACACATGAAACC-3'（序列 5 的第 1-19 位）；
[0067] 引物 GSTR :5' -CAAAATCTGATCGGAATAAACG-3'（序列 5 的第 562-583 位的反向互补 序列）。
[0068] 以步骤一反转录所得cDNA为模板，采用引物GSTF和GSTR进行PCR扩增。反应条 件是：94°C 3min ;94°C 30s、55°C 30s、72°C 30s，35 个循环；72°C lOmin。
[0069] 将所得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。如图2所示，可见PCR产物大小约为583bp。 将PCR产物胶回收后与pMD19-T Simple Vector相连，得到重组质粒，命名为pMD19-GST。 测序表明，重组质粒PMD19-GST在pMD19_T Simple Vector的缺口处连入了序列表中序列 5所示DNA片段。
[0070] 三、麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因 dsRNA的获得
[0071] 1、引物的设计
[0072] 体外合成dsRNA需要带有T7序列的引物，利用Primer5. 0设计并合成如下引物：
[0073] 针对GST基因的引物对如下：
[0074] dsGSTFt :5' -TAATACGACTCACTATAGGAAAGACGATTCGCTGTTC-3' (无下划线部分为序 列2的第1-18位）；
[0075] dsGSTRt :5' -TAATACGACTCACTATAGGATTGCTTGGTGAGGTTG-3'（无下划线部分为序 列2的第396-412位的反向互补序列）。
[0076] 针对作为对照的GFP基因的引物对如下：
[0077] dsGFPFt :5' -TAATACGACTCACTATAGGCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3' (无下划线部分为 序列4的第1-19位）；
[0078] dsGFPRt :5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGTTCACCTTGATGCCGTTC-3 '（无下划线部分为 序列4的第402-420位的反向互补序列）。
[0079] 引物中标有下划线的序列为T7启动子序列。
[0080] 2、合成DNA模版
[0081] 将步骤二所得重组质粒PMD19-GST稀释成浓度为5ng/l·! 1，作为模板，用带有T7启 动子序列的引物对dsGSTFt/dsGSTRt做PCR合成带有T7序列的DNA。
[0082] 将pEGAD质粒稀释成浓度为5ng/l·! 1，作为模板，用带有T7启动子序列的引物对 dsGFPFt/dsGFPRt做PCR合成带有Τ7序列的DNA。
[0083] PCR反应体系：2XTaq Master Mix 10μ 1 ;ddH20 8 μ 1 ;上游引物(λ 5μ 1 ;下游引 物 〇. 5μ1 ;模板 Ιμ?。
[0084] 反应条件：94°C 3min ;94°C 30s、51°C 30s、72°C 40s，38 个循环；72°C lOmin。
[0085] 反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，采用引物对dsGSTFt/dsGSTRt 扩增得到大小约为450bp的DNA片段，进一步测序为"TAATACGACTCACTATAGG+序列 2+CCTATAGTGAGTCGTATTA"。采用引物对 dsGFPFt/dsGFPRt 扩增得到大小约为 458bp 的 DNA 片段，进一步测序为 "TAATACGACTCACTATAGG+ 序列 4+CCTATAGTGAGTCGTATTA"。
[0086] 3、合成 dsRNA
[0087] 以步骤2获得的两端带有T7启动子序列的DNA片段为模板，利用T7Rib〇MAX expression RNAisystem(promega)试剂盒体外高效转录生成麦长管姆的dsRNA片段。
[0088] 体外转录的（T7RiboMax)反应体系：RiboMaxTM Express T72XbufferlO μ L ;DNA 模版 1 μ g ;Enzyme Mix 2 μ L ;RNase Free 水补充至 20 μ L。
[0089] 1)将上述溶液轻轻混勻，置于37°C中金属浴中孵育2hr-6hr ;
[0090] 2)孵育结束后将反应液放于70°C水浴lOmin,缓慢降至室温，约20min ;
[0091] 3)向冷却至室温的反应液中加入1 μ L RQIRNase-Free DNase和1 μ L RNase Solution (RNase Solution 稀释 200 倍）去除模板 DNA 和单链 RNA，37°C温浴 30min ;
[0092] 4)加入与管中溶液等体积的3M醋酸钠水溶液，冰浴5min ;
[0093] 5) 15000rpmin 离心 lOmin ;
[0094] 6)弃上清，用500 μ L 70% (体积分数）乙醇洗两次，弃上清，空气中干燥15min， 加 50 μ L RNase Free 水溶解；
[0095] 7)将产物电泳检测后，放于_80°C超低温冰箱中保存。
[0096] 反应结束后，取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0097] 结果如图3所示，M :D2000plus ;1 :麦长管蚜GST基因体外转录产物dsRNA ;2 :GFP 基因体外转录产物dsRNA ;可以看到，得到目的转录产物。
[0098] 将麦长管蚜GST基因 dsRNA和GFP基因 dsRNA分别测序，结果如下：
[0099] 麦长管蚜GST基因 dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸 序列为序列表中的序列1，其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列1的反向互补序列； [0100] GFP基因 dsRNA为双链RNA，由正义链和反义链组成，其正义链的核苷酸序列为序 列表中的序列3,其反义链的核苷酸序列为序列表中的序列3的反向互补序列。
[0101] 当然，也可以直接人工合成序列1所示的麦长管蚜GST基因 dsRNA和序列3所示 的GFP基因 dsRNA用于下述实施例。
[0102] 实施例2、麦长管蚜GST基因 dsRNA在防治麦长管蚜中的应用
[0103] 一、不同龄期麦长管蚜GST基因的表达量分析
[0104] 在做饲喂实验之前，挑取处于不同龄期的麦长管蚜分别检测GST基因的表达量。 每个龄期（1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫和成虫）选取20头左右的蚜虫提取总RNA 然后检测基因表达量。
[0105] 利用Primer5. 0分别设计不同基因的荧光定量引物，荧光定量引物如下：
[0106] 用于检测麦长管蚜GST基因的引物：
[0107] GSTRTF :5' -AAAAGCGACGACAAAGAG-3'（序列 2 的第 133-150 位）；
[0108] GSTRTR :5' -AAGCGACTAAAGCCACAT-3'（序列 2 的第 236-253 位的反向互补序列）。
[0109] 用于检测内参基因 RpL7Actin的引物：
[0110] 内参基因 RpL7ActinF :5, -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3,；
[0111] 内参基因 RpL7ActinR :5' -GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3'。
[0112] 采用的荧光定量试剂盒为RealMasterMix (SYBR Green)，所用的PCR反应体系为： RealMasterMix 8yL，20XSYBR Sloution lyL，ddH20 9.8 yL，上游引物 O.lyL，下游引 物 0· 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L。扩增反应条件为：94°C 2min ;94°C 20s，54°C 30s，68°C 40s，40 个循环。每个样本重复3次，最后结果用2^6&法（Ct表示循环数）进行计算，AACt = (目的基因的Ct-内参基因的Ct) 目的基因的Ct-内参基因的Ct) ，将1龄幼虫 作为对照组，其ACt = Ctgs?H-Ctrt#SH定义为1.0,其余龄期作为实验组，计算各组的平 均值，进行差异显著性分析。
[0113] 结果如图4所示，可以看出，2龄的麦长管蚜GST基因表达量显著高于成虫期 (P〈0. 05)，但与若虫期差异不显著，说明若虫期GST基因的表达量较稳定。后续试验中采用 2龄麦长管蚜作为研究对照。
[0114] 二、dsRNA的饲喂及最佳饲喂浓度的确定
[0115] 1、麦长管蚜的dsRNA饲喂方法
[0116] 饲喂麦长管蚜时采用的是两端开口直径为2-3. 5cm、长度为3-4cm的玻璃通管。将 Parafilm膜截成1. 5cm2,用手拉展开膜覆盖在玻璃管的一端，放在紫外灯下照射15分钟，然 后在Parafilm膜表面加上150 μ L的人工饲料或者是人工饲料与dsRNA的混合液，再在其上 面另覆盖一层Parafilm膜。将麦长管蚜放入管内，玻璃管的另一端用细棉纱网封住以防止 蚜虫逃逸。将玻璃管放到光照培养箱中饲养，温度22°C ±1°C，相对湿度为85%?90%， 光周期16 : 8(L : D)。选用同龄的蚜虫为供试群体，饥饿4小时左右后接入玻璃管内，每 管内接麦长管蚜15头，每个处理重复2管，实验重复3次。
[0117] 2、饲喂浓度的确定
[0118] 为了确定比较合适的GST基因 dsRNA的饲喂浓度，先采用三个不同浓度的dsRNA 饲喂麦长管蚜（2龄幼虫），饲喂实验在饲喂6天后检测基因的表达量（具体操作参见步 骤一）。采用三组不同的GST基因 dsRNA终浓度分别为Srig/yUlOng/yl^Ong/yU# 5ng/ μ L为例，为将GST基因 dsRNA与人工饲料混合，形成混合液，GST基因 dsRNA在所述混 合液中的终浓度为5ng/μ L。其余浓度所表示含义以此类推）。在实验中以相同浓度的GFP 基因 dsRNA的饲喂为对照。将5ng/ μ L GFP基因 dsRNA对照组的Λ Ct = Ct __ -Ct _基 H定义为1. 〇,计算各组的平均值，进行差异显著性分析。
[0119] 结果显示，采用三种不同浓度的GST基因 dsRNA饲喂麦长管蚜时，与对照相比，麦 长管蚜的GST基因表达量在三种浓度下都显著降低（P〈0. 05)，说明在RNA干扰实验中任意 采用三种浓度都可以达到RNA干扰目的。在后续实验中采用20ng/μ L这个浓度对麦长管 蚜进行RNA干扰实验。具体结果详见图5。
[0120] 三、dsRNA饲喂后麦长管蚜存活率、蜕皮指数及GST基因表达量的测定
[0121] 1、实验方法
[0122] 以2龄麦长管蚜为研究对象，参照上文所述方法对其进行dsRNA饲喂，dsRNA的浓 度选用20ng/μ L，同设置3个处理，S卩GST基因 dsRNA饲喂组（简称dsGST)、GFP基因 dsRNA 饲喂组（简称dsGFP)、以及向人工饲料中加入等量的DEPCH20的对照组。共饲喂6天。用 dsRNA饲喂蚜虫后每天观察麦长管蚜的生长状态，记录麦长管蚜的存活数和蜕皮数。每天 计算每个处理的麦长管蚜的存活率，饲喂6天后计算每个处理的麦长管蚜的蜕皮指数。另 夕卜，饲喂6天后检测每个处理的麦长管蚜GST基因的表达量，其中AACt=(目的基因的 Ct-内参基因的Ct) (目的基因的Ct-内参基因的Ct) ，将DEPCH20对照组的Λ Ct =Ct _ct __定乂为1. 0 (100 *% )，计算各组的平均值，进彳了差异显者性分析。
[0123] 计算公式如下：
[0124] 存活率=前一天的存活虫数/当天的存活虫数X 100% ;
[0125] 蜕皮指数（Im) = Σ (蜕皮数/前一天的存活虫数）。
[0126] 2、实验结果
[0127] (1)麦长管蚜存活数
[0128] 结果显示，dsGST处理组的麦长管蚜5天后存活率开始显著低于对照组（P〈0. 05)， 饲喂6天后蚜虫的存活率仅为44. 45%，而dsGFP对照组为80. 00%，DEPCH20对照组为 76. 99%。从饲喂第1天到第6天处理组和对照组的存活率如下：dsGST处理组的麦长管 蚜存活率分别为 95. 55 %，88. 89 %，77. 78 %，57. 78 %，5L 11 %，44. 45 % ;dsGFP 对照组为 97. 78 %，95. 55 %，93. 33 %，86. 67 %，82. 22 %，80 % ;DEPCH20 对照组为 97. 62 %，93. 01 %， 93. 01%，83. 97%，81. 59%，76. 99%。结果详见图 6。
[0129] (2)麦长管蚜蜕皮指数
[0130] 结果显示，dsGST饲喂能显著降低麦长管蚜的蜕皮指数（P〈0. 05)，阻碍麦长管 蚜的生长，dsGST处理组麦长管蚜的蜕皮指数为1. 30±0. 06 (平均值土标准误），dsGFP 对照组的蜕皮指数为1.73±0.07(平均值土标准误），DEPCH20对照组的蜕皮指数为 1.75±0. 10(平均值土标准误）。结果详见图7。
[0131] (3)GST基因的表达量
[0132] 结果显示，与对照相比，dsGST处理组的麦长管蚜的GST基因表达量降低，显著低 于dsGFP处理组（P〈0. 05)，极显著低于DECH20对照组（P〈0. 001)(图8)。
[0133] 本发明受农业部行业项目"作物蚜虫综合防控技术研究和示范推广（201103022) " 的支持。
【权利要求】
1. 一种dsRNA，为由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互补序列所示的核苷酸组 成的双链RNA。
2. 编码权利要求1所述dsRNA的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中序列2。
3. 含有权利要求2所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系。
4. 权利要求1所述的dsRNA、或权利要求2所述的DNA分子、或权利要求3所述的表达 盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系，在如下（al)-(a5)任一中的应用： (al)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品； (a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品； (a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品； (a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品； (a5)抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达或制备抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转 移酶基因表达的广品。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用为将权利要求1所述的dsRNA导 入麦长管蚜，从而实现防治麦长管蚜、降低麦长管蚜存活率、抑制麦长管蚜生长、降低麦长 管蚜蜕皮指数或抑制麦长管蚜谷胱甘肽-S-转移酶基因表达。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述导入的方式为饲喂。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述饲喂为：将所述dsRNA混合于液体饲 料中，得到混合液；用所述混合液饲喂麦长管蚜； 所述dsRNA在所述混合液中的终浓度为5-20ng/ μ L ; 所述饲喂持续的时间具体为5天以上。
8. 根据权利要求4-7中任一所述的应用，其特征在于：所述麦长管蚜为若虫期麦长管 蚜。
9. 产品，其活性成分为如下A-C中任一种： Α、权利要求1所述的dsRNA ; B、 权利要求2所述的DNA分子； C、 权利要求3所述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因系细胞系； 所述产品具有如下（al)_(a5)功能中的至少一种： (al)防治麦长管蚜； (a2)降低麦长管蚜存活率； (a3)抑制麦长管蚜生长； (a4)降低麦长管蚜蜕皮指数； (a5)抑制麦长管姆谷胱甘肽-S-转移酶基因表达。
10. 抑制麦长管姆谷胱甘肽-S-转移酶基因表达的物质，在如下（al)-(a4)任一中的应 用： (al)防治麦长管蚜或制备防治麦长管蚜的产品； (a2)降低麦长管蚜存活率或制备降低麦长管蚜存活率的产品； (a3)抑制麦长管蚜生长或制备抑制麦长管蚜生长的产品； (a4)降低麦长管蚜蜕皮指数或制备降低麦长管蚜蜕皮指数的产品。
【文档编号】A01N57/16GK104232646SQ201410474737
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】梁荣奇, 赵章武, 邓菲 申请人:中国农业大学